Espectroscopia de la fuerza de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica

Summary

Se describen los procedimientos y estrategias para medir las propiedades mecánicas y las vías despliegue mecánicas de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica. También mostramos resultados representativos como referencia para la selección y justificación de las grabaciones de molécula única de proteína buena.

Abstract

La determinación del proceso de plegado de las proteínas de su secuencia de aminoácidos en su estructura 3D nativa es un problema importante en biología. Microscopía de fuerza atómica (AFM) puede solucionar este problema permitiendo el estiramiento y relajación de las moléculas de proteína única, que da una evidencia directa de despliegue y refolding características específicas. Basada en AFM solo-molécula-espectroscopia de fuerza (AFM-SMF) proporciona un medio para medir consistentemente alta energía conformaciones de las proteínas que no son posibles en las mediciones (bioquímicos) a granel tradicionales. Aunque numerosos artículos fueron publicados para mostrar principios de AFM-SMF, no es fácil llevar a cabo experimentos de SMF debido a la falta de un protocolo de manera exhaustiva completa. En este estudio, nos ilustran brevemente los principios de la AFM y detalle ampliamente los protocolos, procedimientos y análisis de datos como guía para lograr buenos resultados de los experimentos de SMF. Demostramos representante SMF resultados de proteína único mecánico despliegue mediciones y proporcionar resolución de problemas estrategias algunos comúnmente encontrado problemas.

Introduction

Avances en espectroscopía de fuerza sola molécula (SMF) por AFM permitieron manipulación mecánica y caracterización precisa de las moléculas de proteína sola. Esta caracterización ha producido nuevos insights sobre proteína mecánica^1,2, proteína plegable³, de las interacciones proteína-ligando⁴, de las interacciones proteína-proteína⁵, y basados en proteína de ingeniería materiales^6,7,8. SMF es especialmente útil para el estudio de proteína desplegar, estirar por AFM permite los vínculos químicos y físicos dentro de la molécula de proteína para extender gradualmente según su rigidez, que da lugar a una constantemente creciente longitud del contorno. Este estiramiento excesivo de una molécula de proteína puede producir una brusca transición en la curva de fuerza de extensión en un evento de ruptura (o fuerza pico). El pico de fuerza da información directa en el cambio estructural y la fuerza de despliegue de la proteína durante el proceso de despliegue mecánico. Uno de los primeros estudios utilizando AFM mide titin¹ y encontrar aspectos novedosos de la proteína despliegue y refolding bajo condiciones fisiológicas sin el uso de desnaturalizantes antinatural como productos químicos concentrados o temperaturas extremas.

SMF experimentos se llevan a cabo en una variedad de instrumentos, aunque aquí consideramos sólo la AFM. La AFM se compone de cuatro elementos principales: la sonda, el detector, el sostenedor de la muestra y el analizador piezoeléctrico. La sonda es una punta afilada en el extremo bogie de un voladizo. Después de la calibración, doblez del voladizo durante estiramiento de una molécula adjunta se mide utilizando un rayo láser que se refleja la parte de atrás de la micropalanca para determinar precisamente las fuerzas utilizando la ley de Hooke. Los proyectos del haz láser reflejada en un detector de fotodiodo de cuadrante que produce un voltaje proporcional a la dislocación de la viga de láser diodo del centro de la. El sustrato con la muestra de proteína en líquido está montado en un escenario 3D piezoeléctrico que puede ser controlado con precisión sub-nanométrica. Una computadora lee la tensión de los detectores de fotodiodos y controla el escenario 3D a través de una fuente de voltaje controlada por ordenador. Estas etapas del actuador piezoeléctrico se equipan generalmente capacitivo o galga de tensión sensores de posición precisamente desplazamiento de piezo medida y correcta histéresis a través del sistema de control de retroalimentación. La salida de señal de sensor del controlador piezoeléctrico se convierte en distancia mediante la constante tensión de la piezoeléctrico que está calibrado en fábrica. Una curva de fuerza de extensión de ejemplo de un experimento de tracción se muestra en la figura 2.

Hay dos tipos de experimentos de AFM-SMF: velocidad constante y fuerza constante tirando de las mediciones. Medidas de fuerza constante SMF se describen en Oberhauser et al. ⁹, mientras que aquí nos centramos en medidas de velocidad constante. Un típico experimento tirando de velocidad constante AFM realiza proporcionando voltaje a un piezoeléctrico que mueva suavemente el sustrato con respecto a una punta del cantilever. Un experimento típico tiene la punta al principio presionando contra la superficie. La medida de la tracción se inicia moviendo el sustrato de la punta al sacar contacto. Si una proteína entra en contacto con la punta al principio, se tiró y se medirá la huella de despliegue de la fuerza contra desplazamiento. El sustrato luego se trae en contacto con la punta y un rastro relajante se mide en plegamiento de la proteína puede ser determinado por el desplazamiento de la fuerza.

Protocol

1. preparación de la proteína Clonación de ADN. Sintetizar una secuencia de ADN de interés, por ejemplo, la secuencia de ADN de NI10C10, o aislar mediante PCR del organismo anfitrión mediante técnicas de biología molecular estándar11. Flanquean el gen de interés, con sitios de restricción durante la síntesis o mediante la colocación de sitios en el extremo 5′ de los cebadores de la PCR para corresponder a un módulo en el pl…

Representative Results

Resultados representativos de este protocolo se muestran en la figura 2. Ambos paneles muestran las curvas de fuerza representativa-extensión de proteínas. La parte superior muestra los resultados de una poliproteína I91, mientras que la parte inferior muestra la proteína I91 flanqueando un proteína de interés, la molécula de10C de NI. Estas grabaciones muestran la fuerza característica de I91 (200 pN) y el incremento de la longitud del con…

Discussion

Un paso crítico en el protocolo es el uso de una poliproteína, descrito en el paso 1.1.2, que sirve como un control positivo a la “huella digital” eventos de una sola molécula. Generalmente, allí debe ser desplegar eventos de las proteínas de la poliproteína (I91, esto significa una fuerza de despliegue de unos 200 pN y contorno incremento de longitud de aproximadamente 28 nm) a concluir inequívocamente que la proteína de interés se ha revelado. Por ejemplo, cuando la proteína del interés está flanqueada por …

Materials

AFM Specimen Discs, 15mm diameter	Ted Pella, Inc.	16218	Serve as base for glass substrate
Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick	Ted Pella, Inc.	26024	serve as glass substrate and base for gold coating
Adhesive Tabs	Ted Pella, Inc.	16079	Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips
STD Multimode head assembly	Bruker Nano Inc.	1B75C	AFM head
Glass probe holder	Bruker Nano Inc.	MTFML-V2	Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.
Microlever AFM probes	Bruker Nano Inc.	MLCT	Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes
AFM probes with Au coated tips	Bruker Nano Inc.	OBL-10	Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force
Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs	National Instruments	PCI-6259	Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators
LISA Linear Piezo Stage Actuators	Physik Instrumente LP	P-753.11C	Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements
XY Piezo Stage	Physik Instrumente LP	P-541.2CD	Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface