Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin
Summary
Biz ayrıntılı yordamlar ve mekanik özellikleri ve mekanik unfolding yollar tek protein moleküllerinin bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için stratejileri açıklar. Ayrıca seçim ve bloklama iyi tek protein molekülü kayıtları için bir başvuru olarak temsilcisi sonuçları göster.
Abstract
Katlama işlemi yerel 3D yapıları için onların amino asit dizisi üzerinden proteinlerin tayini Biyolojide önemli bir sorundur. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) germe ve belirli unfolding ve özellikleri refolding doğrudan kanıt veren gevşeme tek protein moleküllerinin sağlayarak bu sorunu ele alabilir. AFM tabanlı tek molekül kuvvet-spektroskopisi (AFM-SMFS) sürekli olarak geleneksel toplu (biyokimyasal) ölçümlerde mümkün olmayan proteinler yüksek enerjili biçimler ölçmek için bir yol sağlar. AFM-SMFS prensipleri göstermek için pek çok makalesi yayımlandı rağmen etraflıca bir iletişim eksikliği nedeniyle SMFS deney kolay değildir. Bu çalışmada kısaca AFM prensipleri göstermek ve kapsamlı detay iletişim kuralları, yordamlar ve veri analizi SMFS deneyler iyi sonuçlar elde etmek için bir kılavuz olarak. Biz tek protein mekanik unfolding ölçümleri temsilcisi SMFS sonuçlarını göstermek ve stratejileri için bazı yaygın karşılaşılan sorun giderme sorunları sağlar.
Introduction
Tek molekül kuvvet spektroskopisi (SMFS) tarafından AFM gelişmeler tek protein molekülleri malzemelerin mekanik manipülasyon ve hassas etkinleştirdiniz. Bu karakterizasyonu protein mekaniği1,2,3, protein-ligand etkileşimleri4, protein-protein etkileşimleri5, katlama protein hakkında yeni anlayışlar üretti ve protein bazlı mühendislik malzemeler6,7,8. SMFS protein eğitimi için özellikle yararlı unfolding, yavaş yavaş kendi sertlik verir rise için sürekli artan bir kontur uzunluğu göre genişletmek için protein molekül içinde kimyasal ve fiziksel Tahvil sağlar AFM tarafından germe olarak. Bu bir protein molekülünün esneme ani geçişe rüptürü olayında ortaya çıkan kuvvet-uzantısı eğri üretmek (veya tepe zorla). Gücü en yüksek mekanik açılım sürecinde protein unfolding kuvvet ve yapısal değişikliği doğrudan bilgi verir. AFM kullanarak ilk çalışmalar titin1 ölçülen ve roman yönlerini unfolding ve yoğun kimyasal madde veya aşırı sıcaklıklara gibi doğal olmayan denatüranlar kullanmaya gerek kalmadan fizyolojik koşullar altında refolding protein bulundu.
Burada sadece AFM dikkate da SMFS deneyler aletleri, çeşitli üzerinde yapılmaktadır. AFM dört ana öğelerden oluşur: sonda, Dedektör, örnek sahibi ve piezoelektrik inceden inceye gözden geçirmek. Sonda bir konsol free-swinging ucunda keskin bir yolgösterendir. Kalibrasyon sonra konsol ekli bir molekülünün germe sırasında bükme tam Kuvvetleri Hooke’un Kanunu kullanarak belirlemek için konsol rahat yansıyan lazer ışını kullanılarak ölçülür. Bir lazer ışını diyot Merkezi’nden çıkarılması ile orantılı olarak Sinus bir çeyreği fotodiyot dedektörü yansıyan lazer ışını projelere. Substrat sıvı protein örneği ile alt nanometre hassasiyetle kontrol edilebilir bir 3D piezoelektrik sahne üzerine monte edilmiştir. Bir bilgisayar gerilim fotodiyot dedektörleri okur ve bilgisayar kontrollü voltaj kaynağı 3D adımında denetler. Bu piezo aktüatör aşamalar genellikle kapasitif ile donatılmıştır veya germe-pozisyon sensörleri tam ölçü piezo deplasman ve geri besleme kontrol sistemi aracılığıyla doğru histeresis detektörler. Sensör sinyal çıkış piezo denetleyicisinden fabrika kalibre piezo gerilim sabiti kullanılarak mesafe içine dönüştürülür. Çekerek bir deneme bir örnek kuvvet-uzantısı eğrisi Şekil 2‘ de gösterilmiştir.
AFM-SMFS deneyler iki türü vardır: sabit hız ve sürekli kuvvet ölçümleri çekerek. Sürekli kuvvet SMFS ölçümleri Oberhauser vd. açıklanan Burada sabit hız ölçümleri üzerinde ele iken 9. Tipik bir AFM sabit hızda çekme deneyi yavaşça bir substrat prensibine göre bahşiş göre taşımak için bir piezo gerilim sağlayarak yapılır. Tipik bir deney başlangıçta yüzeyine karşı basarak ucu vardır. Çekerek ölçü belgili tanımlık substrate temasımız getirmek için belgili tanımlık uç uzak hareket ettirerek başladı. Bir protein ile temas ipucu başlangıçta gelirse çekilmiş olacak ve deplasman karşı kuvvet unfolding izleme ölçülecektir. Belgili tanımlık substrate ipucu ile temas geri getirilir ve rahatlatıcı bir izleme nerede protein katlanması kuvvet uzaklığı belirlenebilir ölçülür.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol kritik bir adımda “parmak izi tek molekül olaylar için” olumlu bir denetim olarak hizmet veren 1.1.2, adımda anlatılan bir polyprotein kullanımıdır. Genel olarak, orada polyprotein proteinler olayların unfolding gerekir (I91 için bu yaklaşık 28 yaklaşık 200 pN ve kontur uzunluğu artışı bir açılım güç anlamına gelir nm) belirsizliğe yer bırakmadan faiz protein gelişeceğini olmuştur sonuçlandırmak için. Örneğin, ne zaman faiz protein her iki taraftan üç I91 etki alanı tarafınd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal Bilim Vakfı Hibe MCB-1244297 ve MCB-1517245 PEM için tarafından desteklenmiştir.
Materials
| AFM Specimen Discs, 15mm diameter | Ted Pella, Inc. | 16218 | Serve as base for glass substrate |
| Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick | Ted Pella, Inc. | 26024 | serve as glass substrate and base for gold coating |
| Adhesive Tabs | Ted Pella, Inc. | 16079 | Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips |
| STD Multimode head assembly | Bruker Nano Inc. | 1B75C | AFM head |
| Glass probe holder | Bruker Nano Inc. | MTFML-V2 | Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM. |
| Microlever AFM probes | Bruker Nano Inc. | MLCT | Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes |
| AFM probes with Au coated tips | Bruker Nano Inc. | OBL-10 | Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force |
| Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs | National Instruments | PCI-6259 | Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators |
| LISA Linear Piezo Stage Actuators | Physik Instrumente LP | P-753.11C | Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements |
| XY Piezo Stage | Physik Instrumente LP | P-541.2CD | Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface |
References
- Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
- Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. The study of protein mechanics with the atomic force microscope. Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).
- Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM). Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).
- Rico, F., Chu, C., Moy, V. T., Braga, P. C., Ricci, D. . Methods in Molecular Biology. 736, 331-353 (2011).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Kim, M., et al. Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials. Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).
- Gonzalez, M. A., et al. Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins. Advanced Materials. , (2017).
- Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).
- Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).
- Davis, L. . Basic methods in molecular biology. , (2012).
- Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. , (2016).
- Scholl, Z. N. . The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , (2016).
- Pawlak, K., Strzelecki, J. Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments. Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).
- . Nanopuller Available from: https://sourceforge.net/projects/nanopuller/ (2018)
- Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions. Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).
- Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).
- Su, T., Purohit, P. K. Mechanics of forced unfolding of proteins. Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).
- Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy. Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).
- Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).
- Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of β-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level. Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).
- Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
- Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations. Science. 342 (6159), 741-743 (2013).
- He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy. ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).
- Fotiadis, D., Scheuring, S., Müller, S. A., Engel, A., Müller, D. J. Imaging and manipulation of biological structures with the AFM. Micron. 33 (4), 385-397 (2002).
- Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
- Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins. Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).
- Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a βγ-Crystallin Protein. Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).
