来到光明的一面: 体内糖尿病无毛小鼠慢性伤口生物膜感染的监测
Summary
在这里, 我们描述了一个新的糖尿病小鼠模型利用无毛 real-time, 无创, 监测生物膜伤口感染生物发光的铜绿假单胞菌。该方法可用于评价其他细菌种类和转基因微生物的感染, 包括多生物膜, 并对 antibiofilm 策略的有效性进行测试。
Abstract
在慢性创伤中, 特别是在糖尿病患者中, 细菌的存在是一种结构化的生物膜, 被认为可以防止伤口的愈合和解决。慢性小鼠伤口模型已经被用来理解微生物和宿主之间的潜在相互作用。该模型的发展至今依赖于头发动物的使用和伤口组织的终端收集, 以确定可行的细菌。虽然这些模型已经获得了很大的洞察力, 但这个实验过程需要大量的动物, 取样是费时的。我们开发了一种新的小鼠模型, 它结合了几种最佳的创新方法来评估慢性伤口中生物膜的进展: a) 它利用无毛老鼠, 消除了脱毛的需要;b) 将预先生物膜应用于伤口, 以便立即评估这些社区对宿主的持久性和影响;c) 监测生物膜的进展, 通过量化由基因工程生物荧光菌株的铜绿假单胞菌的光生产, 使 real-time 监测的感染, 从而减少了每项研究所需的动物数量。在该模型中, 在脲佐菌素诱导的糖尿病无毛小鼠的背上产生单全创面, 并在其上接种了铜绿绿脓杆菌生物发光菌株41的生物膜。从伤口的光输出每天记录在一个体内成像系统, 允许在体内和原位快速生物膜可视化和局部化生物膜细菌在伤口。这种新的方法是灵活的, 因为它可以用来研究其他微生物, 包括基因工程物种和多生物膜, 并可能具有特殊价值的测试 anti-biofilm 战略, 包括抗菌闭塞敷料。
Introduction
生物膜是嵌在高分子物质基质中的复杂的微生物群落, 被强调为导致慢性伤口的不良解决的一个因素1。对这些高度有组织的, 持久性微生物种群的研究对于糖尿病患者来说尤为重要, 因为在肢体上的循环不良和周围感觉机制的改变会导致未被察觉的病变2。在美国, 据估计, 15% 的糖尿病患者在生命过程中至少会产生一种溃疡。这转化为经济支出约280亿美元的治疗3,4, 更不用说 immensurable 的情感和社会负担。了解允许微生物群落在创面中持续存在的因素, 以及这些生物膜在愈合过程中所产生的影响, 对于更好地照顾受影响的患者和推动新的治疗方法的发展是势在必行的。因此, 建立可重复和可翻译的在体内模型, 以探索细菌与宿主的相互作用是最重要的。
小鼠模型已经成功地研究了生物膜对慢性伤口的影响。然而, 这些模型经常利用头发的物种, 并通过平板计数来评估生物膜清除量, 为被牺牲的动物切除组织的活细菌细胞, 使它们耗费大量时间和成本。
Contag et al首次提出了一种 biophotonic 的动物在评估感染时的终点取样的替代方法。(1995)5,谁开发了一种方法来捕获发光从组成生物发光的沙门氏菌沙门菌测量抗生素治疗的功效。其它利用生物发光细菌的研究也随之而来。例如, Rochetta et al。(2001)6通过使用增强的电荷耦合装置和后来的 Kadurugamuwa et al来验证感染模型, 以研究大肠杆菌小鼠的大腿感染。(2003)7利用了一株被工程化的金黄色葡萄球菌的光子发射特性, 研究了几种抗生素在小鼠导管伤口模型中的有效性。
该方法的特点是在无毛小鼠中诱导糖尿病的直接协议, 预先生物荧光生物膜产生和接种伤口, 并对感染的铜绿假单胞菌进行 biophotonic 监测。使用在体内成像系统。它提供了一个直接, 快速,原位, 非侵入性和定量的过程, 以评估慢性伤口的生物膜, 此外, 允许额外的分析, 如显微成像愈合伤口, 间歇血液收集细胞因子的测量, 和组织学的晚期组织收集。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们描述了一个新的老鼠模型的研究糖尿病慢性伤口的生物膜有很多优势, 创造一个可复制的, 可翻译的, 灵活的模型。
第一项创新是使用无毛小鼠。其他的小鼠模型已经开发, 以研究糖尿病慢性伤口愈合10,11, 但所有这些都依赖于头发小鼠的使用, 需要脱毛的过程, 包括打蜡或头发修剪结合脱毛霜这一步不仅费时和凌乱, 但可?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者想感谢美国糖尿病协会支持这项工作 (赠款 # #7-13-BS-180), 密歇根州立大学研究技术支持设施, 提供培训和访问的在体内成像系统和密歇根州立大学调查组织病理学实验室为组织病理学检查进行小鼠活检。
Materials
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
References
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