Summary

Işık tarafa: In Vivo izleme bir diyabetik tüysüz fare modelinde kronik yaralarda Pseudomonas aeruginosa biyofilm enfeksiyonların

Published: October 10, 2017
doi:

Summary

Burada gerçek zamanlı, non-invaziv, kollarındaki Pseudomonas aeruginosabiyofilm yara enfeksiyonları izleme için tüysüz fareler kullanan bir roman diyabetik fare modeli açıklar. Bu yöntem diğer bakteri ve genetiği değiştirilmiş mikroorganizmalar, çoklu türler biyofilmler, dahil olmak üzere enfeksiyon değerlendirmek ve antibiofilm stratejileri etkinliğini test etmek için adapte edilebilir.

Abstract

Bakteri varlığı olarak yapılandırılmış biyofilmler özellikle diyabetik hastalarda kronik yaralarda yara iyileşmesi ve çözünürlük önlemek düşünülmektedir. Kronik fare yaralar modelleri mikroorganizmalar ile ana bilgisayar arasındaki temel etkileşimleri anlamak için kullanılmaktadır. Bugüne kadar geliştirilen modelleri tüylü hayvanlar kullanımı ve uygun bakteri tespiti için yara dokusunun terminal koleksiyonu güveniyor. Bu modellerde önemli anlayış kazanmıştır, bu deneysel bir işlem çok sayıda hayvan gerektirir ve örnekleme zaman alıcıdır. Kronik yaralarda biyofilm ilerlemeyi değerlendirmek için birçok en iyi yenilik içermektedir roman bir fare modeli geliştirdik: bir) tüysüz fareler, epilasyon; ihtiyacını ortadan kaldırarak kullanır b) önceden biçimlendirilmiş biyofilmler sunan sebat hemen değerlendirilmesi ve bu toplulukların ana bilgisayar üzerindeki etkisini yaralar için geçerlidir; c) biyofilm ilerleme Pseudomonas aeruginosaböylece hayvan çalışma gerekli sayısını azaltarak enfeksiyon gerçek zamanlı izleme sağlayan, bir genetik kollarındaki suşu tarafından ışık üretim miktarının tarafından izler. Bu modelde, tek bir tam-derinlik yara STZ-indüklenen diyabetik tüysüz fareler arkasında üretilen ve P. aeruginosa kollarındaki yük Xen 41 biyofilmler ile aşılanmış. Yaraları hafif çıktı günlük görüntüleme sistemi, in vivo ve in situ hızlı biyofilm görselleştirme ve yerelleştirme biyofilm bakteri içinde yaralar için izin bir vivo kaydedilir. Diğer mikroorganizmaların genetik türler ve çoklu türler biyofilmler, dahil olmak üzere, çalışma için kullanılan ve test anti-biyofilm stratejileri antimikrobiyal tıkayıcı sosları da dahil olmak üzere özel değeri olabilir roman bu yöntem esnektir.

Introduction

Biyofilmler kronik yaralar1zavallı çözümlenmesi için bir faktör olarak vurgulanmış polimer maddelerin bir matris gömülü mikroorganizmaların karmaşık toplulukları bulunmaktadır. Bu son derece organize, kalıcı mikrobiyal nüfus özellikle bacaklarda ve değiştirilmiş çevresel duyusal mekanizmalar zayıf kan dolaşımı undetected lezyonlar2‘ ye nereye Diyabetik hastalar için önemli bir çalışmadır. Amerika Birleşik Devletleri’nde bu diyabetik hastaların % 15 hayatları boyunca en az bir ülser gelişecektir tahmin edilmektedir. Bu tedavi3,4, 28 milyar dolar civarında bir ekonomik harcama immensurable duygusal ve sosyal yükünü saymıyorum çevirir. Mikrobiyal topluluklar yara yatak ve şifa olaylarda bu biyofilmler etkisi kalıcı olması izin faktörleri anlamak daha iyi bakımı etkilenen hastalar için sürücü ve yeni tedavi yaklaşımları gelişimi itmek için zorunludur. Bu nedenle, bakteriyel konak etkileşimleri keşfetmek için tekrarlanabilir ve çevrilebilir vivo içinde modeller kurulması her şeyden önemlidir.

Fare modelleri başarıyla biyofilmler kronik yaralarda etkisini incelemek için geliştirilmiştir. Bu modeller ancak, sık sık saçlı tür kullanmak ve bakteriyel hücrelerin onları zaman alıcı ve pahalı hale kurban hayvanlardan çıkarılan doku için plaka sayar tarafından biyofilm izni değerlendirmek.

Bitiş noktası örnekleme enfeksiyon değerlendirilmesinde hayvanların bir biophotonic alternatif ilk Contag ve arktarafından önerilmiş. (1995) 5 , kim ışıldama antibiyotik tedavisi etkinliği ölçmek için yapısal kollarındaki Salmonella typhimurium sayfasından yakalamak için bir yöntem geliştirdi. Bioluminescence verilirken bakteri yararlanarak diğer çalışmalar izledi. Örneğin, Rochetta ve ark. (2001) 6 doğrulanmış yoğun bir şarj kuplajlı cihaz kullanarak ışıldama ölçerek Escherichia coli uyluk enfeksiyonlar farelerde çalışmaya bir enfeksiyon modeli ve daha sonra Kadurugamuwa ve ark. (2003) 7 farelerde bir kateter yara modelinde çeşitli antibiyotiklerin etkinliğini araştırmak için Staphylococcus aureus mühendislik bir tür özelliklerini yayan foton kullandı.

Burada karakterize yöntemini diyabet tüysüz farelerde ikna etmek, üretmek ve P. aeruginosa, önceden biçimlendirilmiş kollarındaki biyofilmler yaralarıyla aşılamak ve biophotonic enfeksiyon kontrolü yapmak için basit bir protokol sunar görüntüleme sistemi bir vivo içinde kullanma. O teklif etmek yolu tarif etmek, hızlı, in situ, biyofilmler kronik yaralarda değerlendirmek için non-invaziv ve nicel süreç ve yara iyileşme mikroskobik görüntüleme gibi aralıklı kan toplama için buna ek olarak, ek analiz için sağlar sitokin ölçümleri ve Histoloji terminal dokusu toplamalarında.

Protocol

hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Michigan State University tarafından onaylanmış. 1. hazırlık tıkayıcı sosları ve silikon çubukları şeffaf tıkayıcı soyunma kesmek yapmak için yaklaşık 1 cm x 1 cm makasla kareler. Kes 10 mm daire bir 10 mm biyopsi yumruk. 5 mm biyopsi Merkezi’yle 0,5 mm kalın silikon sayfadaki yumruk 10 mm çemberin ortasında ve sıkıca forma bir delik oluşturmak için basın bir " poğaça "-alç?…

Representative Results

Bu yeni modeli geliştirirken, biz geçmişte kullanmış C57BL/6J fareler üzerinde tüysüz SKH-1 kullanarak pek çok avantajı gözlenen. Hayvanlar STZ enjeksiyonlar için normalde tabi yavaş yavaş kilo kaybı diyabet başlangıcı ile deneyim; Ancak, yarada deneyler şifa daha önce laboratuarlarımızda Dunn ve arktarafından sunulan modeli üreten tarafından yürütülen. (2012) 9 -C57BL/6J, şiddetli kilo kaybı kullanımı (…

Discussion

Burada bir tekrarlanabilir, çevrilebilir ve esnek model oluşturmak için pek çok avantajı vardır biyofilmler diyabetik kronik yaralarda çalışma için yeni bir fare modeli açıklar.

İlk yenilik tüysüz fareler kullanmaktır. Diğer fare modelleri10,11şifa diyabetik kronik yara incelemek için geliştirilmiştir, ama tüm ağda veya saç kırpma ile birlikte ilgili işlemler tarafından kürk kaldırılmasını gerektiren sa?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Amerikan Diyabet Derneği bu eser (Grant # #7-13-BS-180), Devlet Üniversitesi Araştırma teknoloji Michigan Destek Merkezi eğitim ve görüntüleme sistemi vivo içinde erişim sağlamak için destek için teşekkür etmek istiyorum ve Michigan Eyalet Üniversitesi araştırmacı histopatoloji histopatolojik inceleme için fare biyopsileri işlemek için laboratuvarı.

Materials

Opsite Smith & Nephew Model 66000041 Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr Charles River Breeding Laboratories SKH1 Hairless mice, 8 weeks old
Streptozotocin (STZ) Sigma Aldrich S0130-1G Streptozocin powder, 1g
AccuChek glucometer Accu-Chek Roche Art No. 05046025001 ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit
Pseudomonas aeruginosa Xen 41 Perkin Elmer 119229 Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa
Polycarbonate membrane filters Sigma Aldrich P9199 Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) Sigma Aldrich D8537 PBS
Tryptic soy agar Sigma Aldrich 22091 Culture agar
Meloxicam Henry Schein Animal Health 49755 Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection
10% povidone-iodine (Betadine) Purdue Products LP 301879-OA Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case
4% paraformaldehyde Fisher Scientific AAJ61899AK Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS
Capillary glass tube Fisher Scientific 22-362-566 Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes
Silicone to make splints Invitrogen Life Technologies Corp P-18178 Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets
Tryptic soy broth Sigma Aldrich 22092 Culture broth
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system
IVIS Spectrum Isolation chamber Perkin Elmer 123997 XIC-3 animal isolation chamber
HEPA filter Teleflex 28022 Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Biopsy punches VWR International Inc 21909-142 Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.
Biopsy punches VWR International Inc 21909-140 Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.
Glucose J.T.Baker 1916-01 Dextrose, Anhydrous, Powder
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G Citric Acid
Mastisol Eloquest Healthcare HRI 0496-0523-48 Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48
Corning 96-well black plates Fisher Scientific 07-200-567 96-well clear bottom black polysterene microplates
25 gauge 5/8 inch needle BD 305122 Regular bevel needle
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath Branson Ultrasonics N/A Ultrasonic Cleaner

References

  1. James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
  2. Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
  3. Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
  4. Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
  5. Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
  6. Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
  7. Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
  8. Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
  9. Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
  10. Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265 (2013).
  11. Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge – a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
  12. Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
  13. Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
  14. Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).

Play Video

Cite This Article
Hunt, A. M. A., Gibson, J. A., Larrivee, C. L., O’Reilly, S., Navitskaya, S., Busik, J. V., Waters, C. M. Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model. J. Vis. Exp. (128), e55991, doi:10.3791/55991 (2017).

View Video