Här beskriver vi en roman diabetiker murina modell utnyttja hårlösa möss för realtid, icke-invasiv, övervakning av biofilm sårinfektioner av självlysande Pseudomonas aeruginosa. Denna metod kan anpassas till utvärdera infektion i andra bakteriearter och genetiskt modifierade mikroorganismer, inklusive flera arter biofilmer, och testa effekten av antimikrobiella strategier.
Förekomst av bakterier som strukturerade biofilmer i kroniska sår, särskilt hos patienter med diabetes, är tänkt att förhindra sårläkning och upplösning. Kroniska sår musmodeller har använts att förstå underliggande samspelet mellan mikroorganismer och värden. De modeller som utvecklats hittills är beroende av användningen av haired djur och terminal samling av såret vävnad för bestämning av livskraftiga bakterier. Medan betydande insikt har vunnits med dessa modeller, denna experimentella förfarandet kräver ett stort antal djur och provtagning är tidskrävande. Vi har utvecklat en roman murina modell som innefattar flera optimala innovationer för att utvärdera biofilm progression i kroniska sår: en) använder det hårlösa möss, vilket eliminerar behovet av hårborttagning; (b) gäller förformad biofilmer de sår som möjliggör omedelbar utvärdering av beständighet och effekten av dessa samhällen på värd. (c) övervakar biofilm progression av kvantifiering lätt produktion av en genetiskt modifierade självlysande stam av Pseudomonas aeruginosa, möjliggör realtidsövervakning av infektionen vilket minskar antalet djur som krävs per studie. I denna modell, ett enda full-djup sår produceras på baksidan av STZ-inducerad diabetes hårlösa möss och inokuleras med biofilmer av P. aeruginosa självlysande stammen Xen 41. Ljusflöde från såren registreras dagligen i en in-vivo imaging system, vilket möjliggör i vivo och i situ snabba biofilm visualisering och lokalisering av biofilm bakterier i såren. Denna nya metod är flexibel eftersom den kan användas för att studera andra mikroorganismer, inklusive genetiskt modifierade arter och flera arter biofilmer, och kan vara av speciellt värde i anti-biofilm testningsstrategier inklusive antimikrobiella ocklusionsförband.
Biofilmer är komplexa samhällen av mikroorganismer inbäddat i en matris av Polymera substanser som har lyfts fram som en bidragande faktor för kroniska sår1dålig upplösning. Studien av dessa mycket organiserade, ihållande mikrobiella populationer är särskilt viktigt för patienter med diabetes där dålig cirkulation på armar och ben och förändrad perifera sensoriska mekanismer leder till oupptäckta lesioner2. I Förenta staterna uppskattas det att 15% av patienter med diabetes kommer att utveckla minst ett sår under sina liv. Detta innebär att en ekonomisk förbrukning av omkring 28 miljarder dollar i behandling3,4, för att inte nämna de immensurable känslomässiga och sociala påfrestningarna. Förstå de faktorer som gör att mikrobiella samhällen att kvarstå i såret sängen och den inverkan som dessa biofilmer har i helande händelserna är absolut nödvändigt att driva bättre vård för drabbade patienter och driva utvecklingen av nya behandlingsmetoder. Inrättandet av reproducerbara och översättningsbara i vivo modeller för att utforska bakteriell-host interaktioner är därför avgörande.
Murina modeller har utvecklats framgångsrikt för att studera effekterna av biofilmer i kroniska sår. Dessa modeller, men ofta utnyttja haired arter och utvärdera biofilm clearance av plattan räknas för livskraftiga bakterieceller exciderad vävnad från offrade djur, vilket gör dem tidskrävande och kostsamma.
En biophotonic alternativ till slutpunkten provtagning av djur i utvärdera infektion föreslogs först av Contag et al. (1995) 5 , som utvecklat en metod att fånga luminiscens från konstitutivt självlysande Salmonella typhimurium att mäta antibiotikabehandling effekt. Andra studier utnyttjar Mareld-avger bakterier följt. Exempelvis Rochetta et al. (2001) 6 valideras en infektion modell för att studera Escherichia coli låret infektioner hos möss genom att mäta luminescence med en intensifierad kostnad – tillsammans enhet och senare, Kadurugamuwa et al. (2003) 7 drog fördel av fotonen avger egenskaperna för en konstruerad stammar av Staphylococcus aureus att undersöka effekten av flera antibiotika i katetern såret modell hos möss.
Metoden kännetecknas här presenterar ett enkelt protokoll för att inducera diabetes hos hårlösa möss, producera och Inokulera sår med förformad självlysande biofilmer av P. aeruginosa, och genomföra biophotonic övervakning av infektionen använda en in-vivo imaging system. Det erbjuder en direkt, snabb, i situ, icke-invasiv och kvantitativ process för att utvärdera biofilmer i kroniska sår och dessutom möjliggör ytterligare analys såsom mikroskopbilder av läka sår, intermittent blodinsamling för cytokin mätningar och terminal vävnad insamling för histologi.
Här beskriver vi en ny musmodell för studien av biofilmer i diabetiska kroniska sår som har många fördelar med att skapa en reproducerbar, översättningsbara och flexibel modell.
Den första nyheten är användningen av hårlösa möss. Andra musmodeller har utvecklats för att studera diabetiker kronisk sårläkning10,11, men alla har förlitat sig på användningen av haired möss som kräver avlägsnande av päls av processer …
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka American Diabetes Association för att stödja detta arbete (Grant # #7-13-BS-180), Michigan State University teknik Support forskningsanläggningen för att tillhandahålla utbildning och tillgång till den in-vivo imaging system och den Michigan State University undersökande histopatologi Lab för bearbetning av mus biopsier för histopatologisk undersökning.
Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |