Perles base essai Multiplex pour l’analyse des profils de Cytokine de larme

Summary

Analyse du film lacrymal permet de cytokines dans l’étude de diverses maladies oculaires. Dosages multiplex perle basé sont simples et sensibles et permettent l’essai de plusieurs cibles dans les échantillons de petits volumes. Nous décrivons ici un protocole pour tear film cytokine profilage à l’aide d’une perle basé essai multiplex.

Abstract

Film lacrymal est un mélange complexe de lipides, de protéines et de minéraux qui recouvre la surface externe de le œil, fournissant ainsi la lubrification, de nutrition et de protection pour les cellules sous-jacentes. Analyse des larmes est un domaine émergent pour l’identification de biomarqueurs pour la prédiction, diagnostic et pronostic des maladies oculaires différents. Larmes sont facilement accessibles et leur collection est non invasif. Donc, technologies avancées gagnent en importance pour l’identification de plusieurs analytes en larmes pour étudier les changements dans la composition de protéines ou de métabolite et son association avec certaines pathologies. Larme de cytokines sont des biomarqueurs idéales pour l’étude de la santé de la surface oculaire et aussi aider à comprendre les mécanismes des différents troubles de la surfaces oculaire comme maladie de le œil sec et conjonctivite vernal. Dosages multiplex perle basé ont la capacité de détecter plusieurs analytes dans une petite quantité d’échantillon avec une sensibilité plus élevée. Nous décrivons ici un protocole normalisé de prélèvement d’échantillons de larme, extraction et analyse des cytokines profilage à l’aide d’un cordon fonction essai multiplex.

Introduction

Larmes sont produites par la glande lacrymale et les glandes accessoires et enduire la surface externe de le œil. Film lacrymal est constitué d’une couche de lipides externe et une couche interne aqueuse contenant des protéines solubles, mucines et membrane liée mucines. Larmes prévenir les invasions microbiennes, fournissent des nutriments et fourniront une lubrification à la surface oculaire. Larmes agissent comme interface entre l’air et le tissu pour le transport de l’oxygène à la cornée. ¹ film lacrymal est composé de protéines, des glucides, des lipides et des électrolytes. L’association entre les protéines de déchirure avec les maladies systémiques et oculaires comme le glaucome, maladie de sécheresse oculaire, conjonctivite vernal, mellitus de diabète, le cancer et l’Orbitopathie associé à la glande thyroïde a été identifiée dans plusieurs études. ^{2 , 3 , 4} échantillons lacrymal peuvent être recueillis par microcapillaire tubes ou écoulement lacrymal bandes (bandes Schirmer). En outre, test de la Schirmer est une procédure standard suivie dans la cornée et les cliniques de chirurgie réfractive, dont les résultats peuvent servir pour les tests d’analyse de cytokine. Prélèvement d’échantillons non invasifs, accessibilité du bio-spécimen et l’association de la composition de la déchirure avec diverses conditions physiologiques et pathologiques faire déchirer le film une source potentielle de biomarqueurs pour plusieurs maladies oculaires et systémiques. ^{4 , 5 , 6}

Larme de cytokines joue un rôle important dans l’étude de la santé oculaire de surface et des inflammations des diverses maladies oculaires. ⁷ des concentrations anormales de plusieurs cytokines dans les échantillons de le lacrymogènes ont été signalées à être associée à la maladie de l’oeil sec, kératoconjonctivite vernal (VKC), kératoconjonctivite atopique (AKC), la conjonctivite allergique saisonnière et uvéite. ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} larme protéines peuvent être analysées par les méthodes traditionnelles comme la spectrométrie de masse, western blot et dosages immuno-enzymatiques (ELISA). ^{14 , 15} Toutefois, les limitations de ces méthodes sont une sensibilité médiocre et un plus grand volume d’échantillon requis pour l’analyse de plusieurs cytokines larme chez chaque patient. ^{16 , 17} épreuves multiplex perle basé ont été développés afin d’analyser plusieurs analytes dans des échantillons de mélange complexe et appliqués avec succès sur des échantillons de larme d’analyser plusieurs cytokines dans différentes maladies. ^{6 , 18} A combinaison de sandwich ELISA et techniques de cytométrie en flux permettent à ces tests devenir plus sensible que le test ELISA pour la quantification des analytes multiples dans un seul échantillon. ¹⁹ cette méthode peut être appliquée sur une variété d’échantillons cliniques et les surnageants de culture cellulaire et contribue à l’étude des réactions immunitaires dans plusieurs conditions physiopathologiques. ^{20 , 21 , 22 , 23 , 24}

Il existe plusieurs études comparant multiplex perle basé dosages avec ELISA et ont signalé une corrélation entre les méthodes. Loo et coll. comparé perle basé essai multiplex avec classique ELISA pour la détection de l’adiponectine, résistine, la leptine et la ghréline dans des échantillons de sérum ou de plasma humain et a signalé une forte corrélation (r > 0,9) entre les essais. ²⁵ Dupont et coll. a signalé une forte corrélation entre les dosages multiplex perle basé et ELISA pour la détection de l’IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ et le TNF-α de la phytohémagglutinine et lipopolysaccharide stimulent le sang total recueillis auprès de femmes enceintes. ²⁶ Pickering et coll. ont une autre forte corrélation entre essai multiplex perle basé et ELISA pour la détection d’anticorps sériques à Haemophilus influenza type b polysaccharide (r = 0,96), anatoxines de Clostridium tetani (r = 0,96) et Corynebacterium diphtheriae (r = 0,91). ²⁷ Biagini et coll. a signalé une forte corrélation positive (r = 0,852) entre essai multiplex perle basé et ELISA pour la détection de Bacillus anthracis anti-PA IgG dans le sérum. ²⁸ Wang et coll. a signalé une corrélation entre l’essai multiplex perle basé et ELISA pour la détection des biomarqueurs de la maladie d’Alzheimer amyloïde-β 42 (r = 0,77), tau totale (r = 0,94) et tau phosphorylée sur acides aminés 181 (r = 0,82) dans échantillons de liquide céphalorachidien. ²⁹ de ces études ont démontré que l’applicabilité de perle issu des épreuves multiplex divers échantillons cliniques, exigences de volume plus petits échantillon et une corrélation avec la technique ELISA, qui rendent les épreuves multiplex perle basé à un prometteur alternative aux méthodes traditionnelles de ELISA pour la détection de plusieurs analytes dans différent type d’échantillons à des phénotypes différents de la maladie. Nous décrivons ici un protocole normalisé pour essai multiplex perle basé pour le profilage de la cytokine pour 41 analytes en larme échantillons prélevés sur des sujets en bonne santé en utilisant des bandes de Schirmer.

Protocol

les protocoles utilisés dans cette étude ont été approuvées par la Commission de révision institutionnelle de Tan Tock Seng Hospital, Singapour. 1. analyse de Cytokine déchirer Collection de larmes : demander l’objet s’asseoir confortablement sur un fauteuil d’examen et de placer sa tête contre l’appui-tête. Poser la question à chercher, ouvrir les bandes de Schirmer (en filtre Whatman no 41) et placez délicatement l’extrém…

Representative Results

Larme échantillons ont été prélevés de 8 yeux de 4 sujets sains en utilisant des bandes de flux lacrymal et des niveaux de cytokine ont été analysées à l’aide du protocole mentionné ci-dessus. Tous les sujets étaient des hommes et l’âge des quatre sujets était de 36, 42, 44 et 52 ans respectivement. Santé de surface oculaire et sécheresse oculaire la maladie a été évaluée par des tests cliniques (larme film rompre temps, de Schirmer test, coloration cornéenne, colo…

Discussion

Cytokines sont de petites protéines sécrétées cellulaires et puissants immunomodulateurs, régulation des réponses immunitaires. ³² les profils d’expression des cytokines divers échantillons sont associés à diverses pathologies de le œil et les études sur les cytokines profils aident à comprendre les mécanismes de la pathogenèse de la maladie, de déterminer l’état de santé oculaire, la larme gravité de la maladie, le diagnostic et la progression. ² <sup…

Materials

Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit	Merck, USA	HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex instrument	Luminex Corp, Austin, TX, USA
xPonent software	Luminex Corp, Austin, TX, USA
RBXGenerator software	BIO-RAD, France
Bio-Plex Manager 6.1	BIO-RAD, France
Plate shaker	Corning, USA
TECAN Microplate Washer	Tecan, Switzerland	HydroSpeed
Vortex Genie 2	Scientific Industries inc, USA	G560E
Pipettes	Mettler Toledo, CA, USA
1.5ml microcentrifuge tube	Axygen, USA	MCT-150-C
Schirmer tear flow test strip	Eye Care and Cure, USA	101657
Flexmap 3D Calibration Kit	Luminex Corp, Austin, TX, USA	40-028
Flexmap 3D Verfication Kit	Luminex Corp, Austin, TX, USA	40-029
Ocular examination chair