Wulst basierte Multiplex-Assays für die Analyse der Träne Cytokine Profile
Summary
Analyse der Tränenfilm hilft Zytokine in verschiedene augenfällige Krankheiten zu studieren. Wulst basierte Multiplex-Assays sind einfach und empfindlich und ermöglichen das Testen von mehreren Zielen in Proben mit kleinen Volumina. Hier beschreiben wir ein Protokoll für Tear Film Zytokin Profilierung eines mit Wulst basierte Multiplex-Assays.
Abstract
Tränenfilm ist ein komplexes Gemisch von Lipiden, Proteinen und Mineralien umfasst die äußere Oberfläche des Auges, wodurch Schmierung, Ernährung und Schutz für die darunter liegenden Zellen. Analyse der Tränen ist eine aufstrebende Gegend für die Identifizierung von Biomarkern für die Vorhersage, Diagnose und Prognose von verschiedenen augenfälligen Krankheiten. Tränen sind leicht zugänglich und ihre Sammlung ist nicht-invasiv. Daher sind fortschreitende Technologien zur Identifikation von mehreren Analyten in Tränen, Veränderungen im Protein oder Metaboliten Zusammensetzung und seine Verbindung mit pathologischen Bedingungen studieren gewinnt an Bedeutung. Träne Zytokine sind ideale Biomarker für die Gesundheit der Augenoberfläche zu studieren und auch in das Verständnis der Mechanismen von verschiedenen augenfälligen Oberfläche Erkrankungen wie trockenes Augenkrankheit und vernal Konjunktivitis helfen. Wulst basierte Multiplex-Assays sind in der Lage mehrere Analyten in einer kleinen Menge der Probe mit einer höheren Empfindlichkeit zu erkennen. Hier beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll der Träne Musterkollektion, Extraktion und Analyse des Cytokine profiling eine Perle mit Multiplex-Assays basieren.
Introduction
Tränen sind von der Tränendrüse und Zubehör Drüsen produziert und die äußere Oberfläche des Auges zu beschichten. Tränenfilm besteht aus einer äußeren Lipidschicht und einer inneren wässrigen Schicht, die lösliche Proteine enthält, Schleimstoffe und Membran gebunden Schleimstoffe. Tränen verhindern mikrobielle Invasion, Nährstoffe liefern und bieten Schmierung an der Augenoberfläche. Tränen fungieren als Schnittstelle zwischen der Luft und Gewebe für den Sauerstofftransport in die Hornhaut. 1 die Tränenfilm besteht aus Proteinen, Kohlenhydraten, Lipiden und Elektrolyte. Die Zuordnung zwischen Träne Proteine mit Okular und systemische Erkrankungen wie trockenes Augenkrankheit, vernal Konjunktivitis, Glaukom, Diabetes Mellitus, Schilddrüsen-assoziierten Orbitopathy und Krebs wurde in mehreren Studien identifiziert. 2 , 3 , Träne fließen Streifen (Schirmer Streifen) oder 4 Träne Proben können durch Microcapillary Rohre erfasst werden. Darüber hinaus ist der Schirmer-Test ein Standardverfahren durchgeführt in der Hornhaut und refraktive Chirurgie Kliniken, deren, die Ergebnisse für Zytokin Analyse Assays verwendet werden können. Nicht-invasive Probenentnahme, Zugänglichkeit der Bio-Probe und der Verband der Träne Komposition mit verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen machen Film eine potentielle Quelle von Biomarkern für verschiedene augenfällige und systemische Krankheiten reißen. 4 , 5 , 6
Träne Zytokine spielt eine wichtige Rolle bei der Untersuchung der okulären Oberfläche Gesundheit und entzündlichen Erkrankungen der verschiedenen augenfälligen Krankheiten. 7 abnorme Konzentrationen von verschiedenen Zytokinen in Träne Proben wurden berichtet, mit trockenen Augen, vernal Keratokonjunktivitis (VKC), atopische Keratokonjunktivitis (AKC), saisonale allergische Konjunktivitis und Uveitis einhergehen. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Träne Proteine können von den traditionellen Methoden wie Massenspektrometrie, westliche Beflecken und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA) analysiert werden. 14 , 15 sind jedoch die Grenzen dieser Methoden, schlechte Empfindlichkeit und ein größeres Volumen der Probe für die Analyse von mehreren Träne Zytokinen bei jedem Patienten erforderlich. 16 , 17 Bead basierte Multiplex-Assays wurden entwickelt, um mehrere Analyten in komplexen Mischung Proben analysieren und erfolgreich auf Träne Proben analysieren mehrere Zytokine bei verschiedenen Krankheiten angewendet. 6 , 18 A Kombination der Sandwich ELISA und Flow Cytometry Techniken ermöglichen diese Tests zu empfindlicher als ELISA für die Quantifizierung von mehreren Analyten in einer einzigen Probe. 19 diese Methode kann auf einer Vielzahl von klinischen Proben und Zelle Kultur Überstände und hilft bei der Untersuchung von Immunantworten in mehreren pathophysiologischen Bedingungen angewendet werden. 20 , 21 , 22 , 23 , 24
Es gibt mehrere Studien vergleichen Wulst basierte Multiplex mit ELISA Tests und haben eine Korrelation zwischen den Methoden berichtet. Loo Et Al. verglichen Wulst Multiplex-Assays mit konventionellen ELISA zum Nachweis von Adiponectin, resistin, Leptin und Ghrelin im menschlichen Serum bzw. Plasma-Proben und eine starke Korrelation (R > 0,9) zwischen der Assays. 25 Dupont Et Al. berichteten eine starke Korrelation zwischen Wulst basierte Multiplex-Assays und ELISA zum Nachweis von IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ und TNF-α in Phytohemagglutinin und Lipopolysaccharid angeregt Vollblut gesammelt von schwangeren Frauen. 26 Pickering Et Al. berichteten eine weitere starke Korrelation zwischen Wulst basierte Multiplex-Assays und ELISA zum Nachweis von Serum-Antikörper gegen Haemophilus Influenza Typ B Polysaccharid (R = 0.96), Kombinationsimpfung von Clostridium Tetani (R = 0.96), und Corynebacterium Diphtheriae (R = 0,91). 27 Biagini Et Al. berichteten eine hohe positive Korrelation (R = 0.852) zwischen Wulst basierte Multiplex-Assays und ELISA zum Nachweis von Bacillus Anthracis Anti-PA IgG in Serumproben. 28 Wang Et Al. berichteten eine Korrelation zwischen Wulst basierte Multiplex-Assays und ELISA zum Nachweis von Alzheimer-Krankheit Biomarker Amyloid-β 42 (R = 0.77), total Tau (R = 0,94), und Tau auf Aminosäure 181 phosphoryliert (R = 0,82) in Liquor cerebrospinalis Proben. 29 diese Studien haben gezeigt, dass die Anwendbarkeit der Wulst Multiplex-Assays anhand verschiedener klinischen Proben, kleinere Probe Volumenanforderungen und eine Korrelation mit standard ELISA, die Perle basierte Multiplex-Assays eine vielversprechende machen Alternative zu traditionellen ELISA-Methoden zum Nachweis von mehreren Analyten in der unterschiedlichen Art der Proben in verschiedenen Krankheit Phänotypen. Hier beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll für Perle basierte Multiplex-Assay für die Cytokine Profilerstellung für 41 Analyten in Träne Proben von gesunden Probanden mit Schirmer Streifen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zytokine sind kleine zelluläre sekretierten Proteine und potente Immunmodulatoren Regulierung Immunantworten. 32 die Expressionsprofile von verschiedenen Zytokinen in Träne, die Proben sind im Zusammenhang mit verschiedenen pathologischen Zuständen des Auges und Studien über Cytokine Profile helfen zu verstehen, die Mechanismen der Pathogenese der Krankheit, den Zustand der okulären Gesundheit bestimmen, Schwere der Erkrankung, Diagnose und Verlauf. 2 , <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschungsarbeit wurde durch das Zentrum Zuschuss von Tan Tock Seng Krankenhaus personalisiert Seed Finanzierung Programm 2015 unterstützt. Singapur Eye Research Institute Pilot Grant und Tan Tock Seng Krankenhaus Stellplatz für Fonds gewähren.
Materials
| Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit | Merck, USA | HCYTOMAG-60K-41 | |
| Flexmap 3D luminex instrument | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| xPonent software | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| RBXGenerator software | BIO-RAD, France | ||
| Bio-Plex Manager 6.1 | BIO-RAD, France | ||
| Plate shaker | Corning, USA | ||
| TECAN Microplate Washer | Tecan, Switzerland | HydroSpeed | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries inc, USA | G560E | |
| Pipettes | Mettler Toledo, CA, USA | ||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Axygen, USA | MCT-150-C | |
| Schirmer tear flow test strip | Eye Care and Cure, USA | 101657 | |
| Flexmap 3D Calibration Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-028 | |
| Flexmap 3D Verfication Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-029 | |
| Ocular examination chair |
References
- Conrady, C. D., Joos, Z. P., Patel, B. C. Review: The Lacrimal Gland and Its Role in Dry Eye. J Ophthalmol. 7542929, (2016).
- von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. , 126-137 (2013).
- Pieragostino, D., D’Alessandro, M., di Ioia, M., Di Ilio, C., Sacchetta, P., Del Boccio, P. Unraveling the molecular repertoire of tears as a source of biomarkers: beyond ocular diseases. Proteomics Clin Appl. 9 (1-2), 169-186 (2015).
- Azkargorta, M., Soria, J., Acera, A., Iloro, I., Elortza, F. Human tear proteomics and peptidomics in ophthalmology: Toward the translation of proteomic biomarkers into clinical practice. J Proteomics. 150, 359-367 (2017).
- Hagan, S., Martin, E., Enríquez-de-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: potential use for predictive, preventive and personalised medicine. EPMA J. 7, 15 (2016).
- Rentka, A., et al. Membrane array and multiplex bead analysis of tear cytokines in systemic sclerosis. Immunol Res. 64 (2), 619-626 (2016).
- Zhou, L., Beuerman, R. W. Tear analysis in ocular surface diseases. Prog Retin Eye Res. 31 (6), 527-550 (2012).
- Jackson, D. C., et al. Tear Interferon-Gamma as a Biomarker for Evaporative Dry Eye Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4824-4830 (2016).
- Agrawal, R., et al. A distinct cytokines profile in tear film of dry eye disease (DED) patients with HIV infection. Cytokine. 88, 77-84 (2016).
- Uchio, E., Ono, S. Y., Ikezawa, Z., Ohno, S. Tear levels of interferon-gamma, interleukin (IL) -2, IL-4 and IL-5 in patients with vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis and allergic conjunctivitis. Clin Exp Allergy. 30 (1), 103-109 (2000).
- Leonardi, A., Curnow, S. J., Zhan, H., Calder, V. L. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast cultures. Clin Exp Allergy. 36 (6), 777-784 (2006).
- Enríquez-de-Salamanca, A., Calonge, M. Cytokines and chemokines in immune-based ocular surface inflammation. Expert Rev Clin Immunol. 4 (4), 457-467 (2008).
- Carreño, E., et al. Cytokine and chemokine tear levels in patients with uveitis. Acta Ophthalmol. , (2016).
- Bjerrum, K. B., Prause, J. U. Collection and concentration of tear proteins studied by SDS gel electrophoresis. Presentation of a new method with special reference to dry eye patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (7), 402-405 (1994).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- Thakur, A., Willcox, M. D. Cytokine and lipid inflammatory mediator profile of human tears during contact lens associated inflammatory diseases. Exp Eye Res. 67 (1), 9-19 (1998).
- Wei, Y., Gadaria-Rathod, N., Epstein, S., Asbell, P. Tear cytokine profile as a noninvasive biomarker of inflammation for ocular surface diseases: standard operating procedures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8327-8336 (2013).
- Topcu-Yilmaz, P., et al. Determination of tear and serum inflammatory cytokines in patients with rosacea using multiplex bead technology. Ocul Immunol Inflamm. 21 (5), 351-359 (2013).
- Hagan, S., Tomlinson, A. Tear fluid biomarker profiling: a review of multiplex bead analysis. Ocul Surf. 11 (4), 219-235 (2013).
- Choi, R., et al. Serum inflammatory profiles in pulmonary tuberculosis and their association with treatment response. J Proteomics. 149, 23-30 (2016).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer’s disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
- Staples, E., Ingram, R. J., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. J Immunol Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
- Inic-Kanada, A., et al. Comparison of ophthalmic sponges and extraction buffers for quantifying cytokine profiles in tears using Luminex technology. Mol Vis. 18, 2717-2725 (2012).
- Moncunill, G., Aponte, J. J., Nhabomba, A. J., Dobaño, C. Performance of multiplex commercial kits to quantify cytokine and chemokine responses in culture supernatants from Plasmodium falciparum stimulations. PLoS One. 8 (1), e52587 (2013).
- Loo, B. M., Marniemi, J., Jula, A. Evaluation of multiplex immunoassays, used for determination of adiponectin, resistin, leptin, and ghrelin from human blood samples, in comparison to ELISA assays. Scand J Clin Lab Invest. 71 (3), 221-226 (2011).
- Dupont, N. C., Wang, K., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J Reprod Immunol. 66 (2), 175-191 (2005).
- Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (4), 872-876 (2002).
- Biagini, R. E., Sammons, D. L., Smith, J. P., MacKenzie, B. A., Striley, C. A., et al. Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (1), 50-55 (2004).
- Wang, L. S., Leung, Y. Y., Chang, S. K., Leight, S., Knapik-Czajka, M., et al. Comparison of xMAP and ELISA assays for detecting cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 31 (2), 439-445 (2012).
- Kalsow, C. M., Reindel, W. T., Merchea, M. M., Bateman, K. M., Barr, J. T. Tear cytokine response to multipurpose solutions for contact lenses. Clin Ophthalmol. 7, 1291-1302 (2013).
- . The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). The ocular surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Stenger, S., Röllinghoff, M. Role of cytokines in the innate immune response to intracellular pathogens. Ann Rheum Dis. 60, (2001).
- Li, S., et al. Antibody protein array analysis of the tear film cytokines. Optom Vis Sci. 85 (8), 653-660 (2008).
- Tighe, O., Negm, I., Todd, L., Fairclough, Utility, reliability and reproducibility of immunoassay multiplex kits. Methods. 61 (1), 23-29 (2013).
- Dionne, K., Redfern, R. L., Nichols, J. J., Nichols, K. K. Analysis of tear inflammatory mediators: A comparison between the microarray and Luminex methods. Mol Vis. 22, 177-188 (2016).
- Sitaramamma, T., Shivaji, S., Rao, G. N. HPLC analysis of closed, open, and reflex eye tear proteins. Indian J Ophthalmol. 46 (4), 239-245 (1998).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
- Khalifian, S., Raimondi, G., Brandacher, G. The use of luminex assays to measure cytokines. J Invest Dermatol. 135 (4), e31 (2015).
- Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O’Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. J Biomol Screen. 15 (5), 562-568 (2010).
- Berthoud, T. K., et al. Comparison of commercial kits to measure cytokine responses to Plasmodium falciparum by multiplex microsphere suspension array technology. Malar J. 10, 115 (2011).
- Boehm, N., Riechardt, A. I., Wiegand, M., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proinflammatory cytokine profiling of tears from dry eye patients by means of antibody microarrays. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7725-7730 (2011).
- Sack, R., Conradi, L., Beaton, A., Sathe, S., McNamara, N., Leonardi, A. Antibody array characterization of inflammatory mediators in allergic and normal tears in the open and closed eye environments. Exp Eye Res. 85 (4), 528-538 (2007).
