Perle basert Multiplex analysen for analyse av tåre cytokin profiler

Summary

Analyse av tåre filmen cytokiner hjelper i å studere ulike øyet sykdommer. Perle basert multiplex analyser er enkel og følsom og aktiverer testing av flere mål i prøver med små volumer. Her beskriver vi en protokoll for rive filmen cytokin profilering en med perle basert multiplex analysen.

Abstract

Rive filmen er en kompleks blanding av lipider, proteiner og mineraler som dekker den ytre overflaten av øyet, og dermed gir smøring, ernæring og beskyttelse til de underliggende cellene. Analyse av tårer er en voksende område for identifikasjon av biomarkers for prediksjon, diagnose og prognosen for ulike øyet sykdommer. Tårer er lett tilgjengelig og deres samling er ikke-invasiv. Derfor er fremmarsj teknologier økende innflytelse for identifikasjon av flere analytter i tårer å studere endringer i proteiner eller metabolitten komposisjon og dets tilknytning til pathological betingelser. Rive cytokiner er ideelle biomarkers for å studere helse okulær overflaten og også hjelpe forstå mekanismene av ulike okulær overflaten lidelser som tørre øyne-sykdom og vernal konjunktivitt. Perle basert multiplex analyser har evnen til å oppdage flere analytter i en liten mengde utvalg med en høyere følsomhet. Beskriver her vi standardiserte protokollen tåreoppsamling utvalg, utvinning og analyse av cytokin profilering bruker en perle basert multiplex analysen.

Introduction

Tårer er produsert av lacrimal kjertel og tilbehør kjertler og strøk den ytre overflaten av øyet. Rive filmen består av en ytre lipid lag og en indre vandig lag som inneholder løselig proteiner, mucins og membran bundet mucins. Tårer hindre mikrobiell invasjon, levere næringsstoffer og gir smøring på okulær overflaten. Tårer fungere som et grensesnitt mellom luften og vev for oksygen-transport til hornhinnen. ¹ tåre filmen består av proteiner, karbohydrater, lipider og elektrolytter. Tilknytningen mellom tåre proteiner med okulær og systemiske sykdommer som glaukom, tørre øyne-sykdom, vernal konjunktivitt, diabetes mellitus, skjoldbrusk-assosiert orbitopathy og kreft er funnet i flere studier. ^{2 , 3 , 4} tåreprøver kan samles ved microcapillary rør eller rive flyt strimler (Schirmer strimler). I tillegg er til Schirmer test en standard prosedyre utføres i hornhinnen og refraktiv kirurgi klinikker, resultatene som kan brukes til cytokin analyse analyser. Ikke-invasive prøvetaking, tilgjengelighet av bio-prøven og foreningen av tåre komposisjon med ulike fysiologiske og patologiske forhold gjør rive filmen en potensiell kilde til biomarkers for flere okulær og systemiske sykdommer. ^{4 , 5 , 6}

Rive cytokiner spiller en viktig rolle i å studere okulær overflaten helse og inflammatoriske tilstander av ulike øyet sykdommer. ⁷ unormal konsentrasjoner av flere cytokiner i tåreprøver ble rapportert å være assosiert med tørre øyne-sykdom, vernal keratoconjunctivitis (VKC), atopisk keratoconjunctivitis (AKC), sesongmessige allergisk konjunktivitt og uveitis. ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} tåre proteiner kan analyseres av tradisjonelle metoder som massespektrometri, vestlige blotting og enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISA). ^{14 , 15} men begrensningene for disse metodene er dårlig følsomhet og et større volum av prøve kreves for analyse av flere tåre cytokiner i hver pasient. ^{16 , 17} perle basert multiplex analyser har blitt utviklet for å analysere flere analytter i kompleks blanding prøvene og brukt på rive prøver å analysere flere cytokiner i ulike sykdommer. ^{6 , 18} A kombinasjon av sandwich ELISA og flyt cytometri teknikker gjør disse analyser blir mer følsom enn ELISA for kvantifisering av flere analytter i en enkelt prøve. ¹⁹ denne metoden kan brukes på en rekke kliniske prøver og celle kultur supernatants og hjelper i studiet av immunreaksjoner i flere patofysiologiske forhold. ^{20 , 21 , 22 , 23 , 24}

Det er flere studier sammenligne perle basert multipleks søk med ELISA og har rapportert en sammenheng mellom metodene. Do et al. sammenlignet perle basert multiplex analysen med konvensjonelle ELISA for påvisning av adiponectin, resistin, leptin og ghrelin i prøver fra mennesker serum- eller og rapportert en sterk sammenheng (r > 0,9) mellom analyser. ²⁵ Dupont et al. rapportert en sterk sammenheng mellom perle basert multiplex analyser og ELISA for påvisning av IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ og TNF-α phytohemagglutinin og lipopolysakkarid stimulert fullblod samlet fra gravide. ²⁶ Pickering et al. rapportert en sterk sammenheng mellom perle basert multiplex analysen og ELISA for påvisning av serum antistoffer mot Haemophilus influensa type b polysakkarid (r = 0.96), toxoids av Clostridium tetani (r = 0.96), og Corynebacterium diphtheriae (r = 0,91). ²⁷ Biagini et al. rapportert en høy positiv korrelasjon (r = 0.852) mellom perle basert multiplex analysen og ELISA deteksjon av Bacillus anthracis anti-PA IgG i serumprøver. ²⁸ Wang et al. rapportert en sammenheng mellom perle basert multiplex analysen og ELISA for påvisning av Alzheimers biomarkers amyloid-β 42 (r = 0.77), totalt tau (r = 0,94), og tau fosforylert på aminosyre 181 (r = 0,82) i Cerebrospinalvæske prøver. ²⁹ disse studiene har vist anvendelse av perle basert multiplex analyser på rekke kliniske prøver, mindre utvalg volumkrav og en sammenheng med standard ELISA, som gjør perle basert multiplex analyser en lovende alternativ til tradisjonelle ELISA metoder for påvisning av flere analytter i forskjellige typer prøver forskjellige sykdommen fenotyper. Her beskriver vi en standardisert protokoll for perle basert multiplex analysen for cytokin profilering for 41 analytter i tåreprøver fra sunn fag med Schirmer strimler.

Protocol

protokollene som brukes i denne studien var godkjent av institusjonelle gjennomgang styret Tan takk Seng Hospital, Singapore. 1. Riv cytokin analyse samling av tårer: be personen(e) som sitter komfortabelt på en undersøkelse stol og plassere hodet mot nakkestøtten. Spør emnet å slå opp, nøye åpne Schirmer strimler (laget av Whatman filter papir nr 41) og plassere avrundet slutten av stripen på de underlegne fornix av øyet og instruere …

Representative Results

Innhentet tåreprøver fra 8 øynene til 4 sunn fag ved hjelp rive flyt strimler og cytokin nivåer ble analysert ved hjelp av ovennevnte protokollen. Alle fag var mannlige og en alder av fire fagene var 36, 42, 44 og 52 år henholdsvis. Okulære overflaten helse og tørre øyne sykdom ble evaluert av kliniske tester (rive filmen bryte opp tid, Schirmerfamiliens test, hornhinnen flekker, conjunctival flekker, lokket/meibomian kjertel eksamen, hornhinnen tåre tegn og visuelle tegn og symp…

Discussion

Cytokiner er små mobilnettet utskilles proteiner og potent immun modulatorer regulere immunreaksjoner. ³² uttrykket profiler av ulike cytokiner i tåre prøver er knyttet til ulike patologiske forhold av øyet og studier av cytokin profiler å forstå sykdom patogene mekanismer, bestemme okulær helsetilstanden, sykdommens alvorlighetsgrad, diagnostisering og progresjon. ^{2 , 5} lavere protein konsentrasjoner og lite utvalg volumer er hoved…

Materials

Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit	Merck, USA	HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex instrument	Luminex Corp, Austin, TX, USA
xPonent software	Luminex Corp, Austin, TX, USA
RBXGenerator software	BIO-RAD, France
Bio-Plex Manager 6.1	BIO-RAD, France
Plate shaker	Corning, USA
TECAN Microplate Washer	Tecan, Switzerland	HydroSpeed
Vortex Genie 2	Scientific Industries inc, USA	G560E
Pipettes	Mettler Toledo, CA, USA
1.5ml microcentrifuge tube	Axygen, USA	MCT-150-C
Schirmer tear flow test strip	Eye Care and Cure, USA	101657
Flexmap 3D Calibration Kit	Luminex Corp, Austin, TX, USA	40-028
Flexmap 3D Verfication Kit	Luminex Corp, Austin, TX, USA	40-029
Ocular examination chair