Bead baserat Multiplex Assay för analys av tår cytokin profiler

Summary

Analys av tårfilmen cytokiner hjälper till att studera olika ögonsjukdomar. Bead baserat multiplex analyser är enkla och känslig och aktivera testning av flera mål i prover med små volymer. Här beskriver vi ett protokoll för tear film cytokin profilering ett använder pärla baserat multiplex assay.

Abstract

Tårfilmen är en komplex blandning av lipider, proteiner och mineraler som täcker den yttre ytan av ögat, vilket ger smörjning, näring och skydd till underliggande celler. Analys av tårar är en framväxande område för identifiering av biomarkörer för prediktion, diagnos och prognos av olika ögonsjukdomar. Tårar är lättillgängliga och deras samling är icke-invasiv. Därför vinner framryckande teknik framträdande för identifiering av flera analyter i tårar att studera förändringar i protein eller metabolit sammansättning och dess samband med sjukdomstillstånd. Tår cytokiner är idealisk biomarkörer för att studera hälsa i den okulära ytan och också hjälpa att förstå mekanismerna bakom olika okulära ytan störningar som kroniskt torra ögon och vernal konjunktivit. Bead baserat multiplex analyser har förmåga att upptäcka flera analyter i en liten mängd av provet med en högre känslighet. Beskriver här vi ett standardiserat protokoll för tår provtagning, extraktion och analys av cytokin profilering med en pärla baserat multiplex assay.

Introduction

Tårar produceras av tårkörteln och tillbehör körtlar och bestryka den yttre ytan av ögat. Tårfilmen består av en yttre lipidskikt och en inre vattenskiktet som innehåller lösliga proteiner, muciner och membran bundna muciner. Tårar förhindra mikrobiell invasion, levererar näringsämnen och ger smörjning till den okulära ytan. Tårar fungera som förbindelselänk mellan luft och vävnad för syretransport till hornhinnan. ¹ tårfilmen består av proteiner, kolhydrater, lipider och elektrolyter. Associationen mellan tår proteiner med okulära och systemiska sjukdomar som kroniskt torra ögon, glaukom, diabetes mellitus, vernal konjunktivit, sköldkörtel-associerade orbitopathy och cancer har upptäckts i flera studier. ^{2 , 3 , 4} tår prover kan samlas in av microcapillary rör eller tårflöde remsor (Schirmer remsor). Dessutom är den Schirmer’s test ett standardförfarande som utförs i hornhinnan och refraktiv kirurgi kliniker, vars resultat kan användas för cytokin analys analyser. Icke-invasiv provtagning, tillgänglighet av bio-förlagan, och föreningen av tår sammansättning med olika fysiologiska och patologiska förhållanden gör tear film en potentiell källa till biomarkörer för flera okulära och systemiska sjukdomar. ^{4 , 5 , 6}

Tår cytokiner spelar en viktig roll i att studera den okulära ytan hälsa och inflammatoriska tillstånd i olika ögonsjukdomar. ⁷ onormala koncentrationer av flera cytokiner i tår prover rapporterades vara associerade med kroniskt torra ögon, vernal keratokonjunktivit (VKC), atopisk keratokonjunktivit (AKC), säsongsbunden allergisk konjunktivit och uveit. ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} tår proteiner kan analyseras genom traditionella metoder såsom masspektrometri, western blotting och enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). ^{14 , 15} begränsningarna av dessa metoder är dock dålig känslighet och en större volym av provet krävs för analys av flera tår cytokiner hos varje patient. ^{16 , 17} pärla baserat multiplex analyser har utvecklats för att analysera flera analyter i komplex blandning prover och tillämpats på tår prover att analysera flera cytokiner i olika sjukdomar. ^{6 , 18} A kombination av sandwich-ELISA och flöde flödescytometri tekniker möjliggör dessa analyser att bli känsligare än ELISA för kvantifiering av flera analyter i ett enda prov. ¹⁹ denna metod kan tillämpas på en mängd kliniska prover och cell cellkulturer och hjälper till i studien av immunsvaret i flera patofysiologiska förhållanden. ^{20 , 21 , 22 , 23 , 24}

I området i närheten finns det flera studier jämförde pärla baserat multiplex-analyser med ELISA och har rapporterat ett samband mellan metoderna. Loo et al. jämförde pärla baserat multiplex assay med konventionella ELISA för detektion av adiponectin, resistin, leptin och ghrelin i humant serum eller plasma prover och rapporterade en stark korrelation (r > 0,9) mellan analyserna. ²⁵ Dupont et al. rapporterade en stark korrelation mellan pärla baserat multiplex analyser och ELISA-test för påvisande av IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ och TNF-α i phytohemagglutinin och lipopolysackarid stimuleras helblod samlat från gravida kvinnor. ²⁶ Pickering et al. rapporterade en annan stark korrelation mellan pärla baserat multiplex assay och ELISA-test för påvisande av serumantikroppar till Hemophilus influensa typ b polysackarid (r = 0,96), toxoider av Clostridium tetani (r = 0,96), och Corynebacterium diphtheriae (r = 0,91). ²⁷ Biagini et al. rapporterade en hög positiv korrelation (r = 0,852) mellan pärla baserat multiplex assay och ELISA-test för påvisande av Bacillus anthracis anti-PA IgG i serumprover. ²⁸ Wang et al. rapporterade en korrelation mellan pärla baserat multiplex assay och ELISA-test för påvisande av Alzheimers sjukdom biomarkörer amyloid-β 42 (r = 0,77), totalt tau (r = 0,94), och tau fosforyleras på aminosyran 181 (r = 0,82) i cerebrospinalvätska prover. ²⁹ dessa studier har visat tillämpligheten av pärla utifrån olika kliniska prover, mindre prov volymkrav och en korrelation med standard ELISA, som gör pärla baserat multiplex analyser en lovande multiplex analyser alternativ till traditionell ELISA metoder för detektion av flera analyter i annan typ av prover i olika sjukdomen fenotyper. Här beskriver vi ett standardiserat protokoll för bead baserat multiplex assay för cytokin profilering för 41 analyter i tår prover som tagits från friska försökspersoner med Schirmer remsor.

Protocol

de protokoll som används i denna studie godkändes av den institutionella Granskningsnämnden Tan Tock Seng Hospital, Singapore. 1. Riva cytokin analys samling av tårar: be motivet att sitta bekvämt på en undersökning stol och placera hans/hennes huvud mot nackstödet. Be motivet att titta, försiktigt öppna Schirmer remsorna (gjorda av filterpapper Whatman nr 41) och placera den runda änden av remsan på sämre fornix i ögat och instruer…

Representative Results

Tår prover samlades från 8 ögon 4 friska försökspersoner med tår flöde remsor och cytokin nivåer analyserades med hjälp av ovan nämnda protokollet. Alla ämnen var män och år de fyra ämnena var 36, 42, 44 och 52 år respektive. Okulära ytan hälsa och torra ögon sjukdom utvärderades genom kliniska tester (tear film bryta upp tid, Schirmer’s test, korneal missfärgning, konjunktival färgning, lock/meibomian körtel undersökning, korneal tår tecken och visuella tecken och…

Discussion

Cytokiner är små cellproteiner utsöndras och potent immun modulatorer reglerar immunsvar. ³² de uttrycket profilerna av olika cytokiner i tår prover är relaterade till olika sjukdomstillstånd i ögat och studier på cytokin profiler hjälpa att förstå mekanismerna bakom sjukdomspatogenes, avgöra okulär hälsotillstånd, sjukdomens svårighetsgrad, diagnos och progression. ^{2 , 5} lägre protein koncentrationer och små provmängder…

Materials

Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit	Merck, USA	HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex instrument	Luminex Corp, Austin, TX, USA
xPonent software	Luminex Corp, Austin, TX, USA
RBXGenerator software	BIO-RAD, France
Bio-Plex Manager 6.1	BIO-RAD, France
Plate shaker	Corning, USA
TECAN Microplate Washer	Tecan, Switzerland	HydroSpeed
Vortex Genie 2	Scientific Industries inc, USA	G560E
Pipettes	Mettler Toledo, CA, USA
1.5ml microcentrifuge tube	Axygen, USA	MCT-150-C
Schirmer tear flow test strip	Eye Care and Cure, USA	101657
Flexmap 3D Calibration Kit	Luminex Corp, Austin, TX, USA	40-028
Flexmap 3D Verfication Kit	Luminex Corp, Austin, TX, USA	40-029
Ocular examination chair