Kraal gebaseerd Multiplex Assay voor analyse van Tear Cytokine profielen

Summary

Analyse van de traanfilm cytokines helpt bij het bestuderen van verschillende oogbeschadigingen en/of ziekten. Kraal gebaseerd multiplex assays zijn eenvoudig en gevoelige en activeer het testen van meerdere doelen in monsters met kleine volumes. Hier beschrijven we een protocol voor scheur film cytokine profielen met behulp van een kraal gebaseerd multiplex assay.

Abstract

Traanfilm is een complex mengsel van lipiden, eiwitten en mineralen, die betrekking heeft op het buitenoppervlak van het oog, waardoor smering, voeding en bescherming aan de onderliggende cellen. Analyse van tranen is een opkomende gebied voor de identificatie van biomarkers voor de voorspelling, diagnose en prognose voor verschillende oogbeschadigingen en/of ziekten. Tranen zijn gemakkelijk te bereiken en hun collectie is niet-invasief. Daarom zijn oprukkende technologieën wint aan bekendheid voor de identificatie van meerdere analyten in tranen te bestuderen van de veranderingen in de samenstelling van het eiwit of metaboliet en haar connectie met pathologische condities. Scheur cytokines zijn ideale biomarkers voor de gezondheid van de oculaire oppervlakte bestuderen en ook helpen bij het begrijpen van de mechanismen van de verschillende oogbeschadigingen en/of oppervlakte stoornissen zoals droge oogziekte en vernal conjunctivitis. Kraal gebaseerd multiplex assays hebben de mogelijkheid voor het opsporen van meerdere analyten in een kleine hoeveelheid monster met een hogere gevoeligheid. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd protocol voor scheur sample collectie, extractie en analyse van cytokine profielen met behulp van een kraal op basis van multiplex assay.

Introduction

Tranen worden geproduceerd door de traanklier en accessoire klieren en jas van de buitenkant van het oog. Traanfilm bestaat uit een buitenste lipide-laag en een waterige binnenlaag die oplosbare eiwitten bevat, mucinen en membraan gebonden mucinen. Tranen voorkomen van microbiële invasie, voedingsstoffen te verstrekken en geven smering aan de oculaire oppervlakte. Tranen fungeren als intermediair tussen de lucht en weefsel voor zuurstoftransport naar het hoornvlies. ¹ traanfilm is samengesteld uit eiwitten, koolhydraten, lipiden en elektrolyten. De associatie tussen scheur eiwitten met oogbeschadigingen en/of en systemische ziekten zoals glaucoom, droge oogziekte, vernal conjunctivitis, diabetes mellitus, schildklier-geassocieerde orbitopathy en kanker is geconstateerd in verschillende studies. ^{2 , 3 , 4} scheur monsters kunnen worden genomen door microcapillary buizen of scheur stroom strips (Schirmer strips). Daarnaast is de Schirmertest een standaardprocedure in het hoornvlies en de refractieve chirurgie klinieken, waarvan de resultaten kunnen worden gebruikt voor de cytokine analyse tests uitgevoerd. Niet-invasieve sample collectie, toegankelijkheid van het bio-model, en de vereniging van scheur samenstelling met verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden maken scheuren film een potentiële bron van biomarkers voor verschillende oogbeschadigingen en/of en systemische ziekten. ^{4 , 5 , 6}

Scheur cytokines speelt een belangrijke rol bij het bestuderen van de oculaire oppervlakte gezondheid en inflammatoire voorwaarden van verschillende oogbeschadigingen en/of ziekten. ⁷ abnormale concentraties van verschillende cytokines in scheur monsters werden gemeld te worden geassocieerd met droge oogziekte, vernal keratoconjunctivitis (VKC), atopische keratoconjunctivitis (AKC), seizoensgebonden allergische conjunctivitis en uveitis. ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} scheur eiwitten kunnen door traditionele methoden als massaspectrometrie, het westelijke bevlekken en enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) worden geanalyseerd. ^{14 , 15} de beperkingen van deze methoden zijn echter slechte gevoeligheid en een grotere hoeveelheid monster nodig zijn voor de analyse van meerdere scheur cytokines in elke patiënt. ^{16 , 17} kraal gebaseerd multiplex assays zijn ontwikkeld om meerdere analyten in complex mengsel monsters te analyseren en met succes toegepast op scheuren monsters te analyseren van meerdere cytokines in verschillende ziekten. ^{6 , 18} A combinatie van sandwich-ELISA en stroom cytometry technieken kunnen deze testen worden gevoeliger dan ELISA voor de kwantificering van meerdere analyten in één sample. ¹⁹ deze methode kan worden toegepast op een verscheidenheid van klinische monsters en cel cultuur supernatant en helpt in de studie van de immuunrespons in meerdere pathofysiologische omstandigheden. ^{20 , 21 , 22 , 23 , 24}

Er zijn verschillende studies vergelijken kraal gebaseerd multiplex testen met ELISA en hebben gemeld een correlatie tussen de methoden. Loo et al. vergeleken kraal gebaseerd multiplex assay met conventionele ELISA voor de opsporing van adiponectin, resistin, leptine en ghreline in menselijke specimens van serum of plasma en gemeld van een sterke correlatie (r > 0.9) tussen de testen. ²⁵ Dupont et al. rapporteerde een sterke correlatie tussen kraal gebaseerd multiplex assays en ELISA voor de opsporing van IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ en TNF-α in phytohemagglutinin en lipopolysaccharide gestimuleerd volbloed verzameld van zwangere vrouwen. ²⁶ Pickering et al. rapporteerde een andere sterke correlatie tussen kraal gebaseerd multiplex assay en ELISA voor de opsporing van serum antilichamen tegen Haemophilus influenzae type b polysaccharide (r = 0,96), toxoids van Clostridium tetani (r = 0,96), en Corynebacterium diphtheriae (r = 0.91). ²⁷ Biagini et al. rapporteerde een hoge positieve correlatie (r = 0.852) tussen kraal gebaseerd multiplex assay en ELISA voor de opsporing van Bacillus anthracis anti-PA IgG in serummonsters. ²⁸ Wang et al. rapporteerde een correlatie tussen kraal gebaseerd multiplex assay en ELISA voor de opsporing van de ziekte van Alzheimer biomarkers amyloid-β 42 (r = 0.77), totale tau (r = 0.94), en tau phosphorylated op aminozuur 181 (r = 0.82) in monsters van de cerebrospinale vloeistof. ²⁹ deze studies hebben aangetoond dat de toepasselijkheid van de kraal multiplex assays gebaseerd op diverse klinische monsters, kleinere steekproef volume eisen en een correlatie met standaard ELISA, waardoor kraal gebaseerd multiplex assays een veelbelovende alternatief voor de traditionele methoden van de ELISA voor de opsporing van meerdere analyten in verschillende soort monsters in andere ziekte fenotypen. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd protocol voor kraal gebaseerd multiplex assay voor het cytokine profielen voor 41 analyten in scheur monsters verzameld van gezonde proefpersonen gebruik Schirmer strips.

Protocol

de protocollen die worden gebruikt in deze studie werden goedgekeurd door de board van de institutionele beoordeling van Tan Tock Seng ziekenhuis, Singapore. 1. scheur Cytokine analyse collectie van tranen: vragen het onderwerp te comfortabel zitten op de stoel van een onderzoek en zijn/haar hoofd tegen de hoofdsteun. Vraag het onderwerp opzoeken, zorgvuldig openen de Schirmer strips (gemaakt van het filtreerpapier Whatman nr. 41) en plaats het a…

Representative Results

Scheur monsters werden verzameld uit 8 ogen van 4 gezonde proefpersonen gebruik scheur stroom strips en cytokine niveaus werden geanalyseerd met behulp van het hierboven genoemde protocol. Alle onderwerpen zijn mannelijke en de leeftijd van de vier onderwerpen was 36, 42, 44 en 52 jaar respectievelijk. Oogbeschadigingen en/of oppervlakte gezondheid en droge ogen ziekte werd beoordeeld door klinische tests (scheur film breken tijd, Schirmer van test, hoornvlies verkleuring, conjunctivale k…

Discussion

Cytokines zijn kleine cellulaire secreted eiwitten en krachtige immuun modulatoren, regulering van de immuunrespons. ³² de expressieprofielen van diverse cytokinen in scheur monsters zijn gerelateerd aan verscheidene pathologische condities van het oog en studies over cytokine profielen helpen om te begrijpen van de mechanismen van de pathogenese van de ziekte, het vaststellen van oogbeschadigingen en/of gezondheid, Ernst van de ziekte, de diagnose en de progressie. ^{2 …}

Materials

Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit	Merck, USA	HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex instrument	Luminex Corp, Austin, TX, USA
xPonent software	Luminex Corp, Austin, TX, USA
RBXGenerator software	BIO-RAD, France
Bio-Plex Manager 6.1	BIO-RAD, France
Plate shaker	Corning, USA
TECAN Microplate Washer	Tecan, Switzerland	HydroSpeed
Vortex Genie 2	Scientific Industries inc, USA	G560E
Pipettes	Mettler Toledo, CA, USA
1.5ml microcentrifuge tube	Axygen, USA	MCT-150-C
Schirmer tear flow test strip	Eye Care and Cure, USA	101657
Flexmap 3D Calibration Kit	Luminex Corp, Austin, TX, USA	40-028
Flexmap 3D Verfication Kit	Luminex Corp, Austin, TX, USA	40-029
Ocular examination chair