조사 항목의 모드와 항진균 공장 Defensins의 Subcellular 지 방화 하는 곰 팡이 세포의 라이브 셀 이미징

Summary

식물 defensins 병원 균에 대 한 식물 방어에 중요 한 역할을 재생. 대 한 항진균 요원, 액션 (MOA)의 그들의 모드를 이해로 이러한 항진균 펩 티 드의 효과적인 사용이 중요 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 방법 공부 이러한 펩 티이 드의 MOA의 중요 한 측면을 설명 합니다.

Abstract

작은 시스테인-부자 defensins 모든 식물에 호스트 방어 펩 티 드의 가장 큰 그룹 중 하나입니다. 많은 식물 defensins 곰 팡이 병원 균의 넓 스펙트럼에 대 한 강력한 생체 외에서 항진균 성 활동을 전시 하 고 따라서 유전자 변형 작물에 항진균 성 대리인으로 사용 될 가능성이 있다. 질병 제어를 위한 식물 defensins의 잠재력을 활용 하기 위해 그들의 행동 (MOA)의 메커니즘을 명료 하 게 결정적 이다. 고급 현미경 검사 법 기술의 도래와 함께 라이브 셀 이미징 식물 defensins의 항진균 MOA의 역학을 이해 하기 위한 강력한 도구가 되고있다. 여기, confocal 현미경 검사 법 기반 라이브 세포 이미징 방법 중요 한 형광 염료와 함께에서 두 붙일 레이블된 공장 defensins (MtDef4 및 MtDef5)를 사용 하 여 설명 합니다. 이 기술은 실시간 시각화 및 곰 팡이 세포에 MtDef4 및 MtDef5 국제화의 동적 이벤트의 분석을 수 있습니다. 중요 한 것은,이 분석 결과 다양 한 국제화 활동, 항목의 모드와 이러한 펩 티이 드의 subcellular 지 방화를 포함 하 여 정보를 생성 합니다. 다른 셀 생물 학적 도구를 이러한 방법 역학과 이러한 펩 티이 드의 MOA의 복잡성에 대 한 중요 한 통찰력 제공. 이러한 도구는 또한 다른 버섯에 대 한 이러한 펩 티이 드의 MOA 비교 하 사용할 수 있습니다.

Introduction

식물 미생물 식물 병원 체¹에 대 한 방어에 대 한 정교한 타고 난 면역 체계를 진화 했다. 그들은 수많은 유전자 인코딩 호스트 방어 펩 putative 항균 활동²익스프레스. 실제로, 많은 이러한 펩 티이 드의 항균 활동 생체 외에서³표시합니다. Defensins 식물 왕국⁴호스트 방어 펩 티 드의 가장 큰 그룹 중 구성 됩니다. 이 시스테인-부자, 양이온 펩 티 드 곰 팡이 대 한 강력한 성장 억제 활동 전시 및 micromolar 농도 및 이러한 병원 균^5,6에 대 한 방어의 첫 번째 라인 중 하나에서 oomycete 병원 체. 그들의 강력한 항진균 활동 때문에 defensins agribiotechnological 저항 하는 질병 작물을 생성 하기 위해 응용 프로그램에 악용 될 수 있습니다. 여러 식물 defensins의 제정 overexpression 유전자 변형 작물⁶온실 및 필드 테스트에 질병 저항을 향상 시키기 위해 표시 되었습니다. 그것은 완전히 작물 보호를 위한 효과적인 도구로 서 자신의 잠재력을 활용 하기 위해서는 이러한 항진균 펩 티 드의 행동 (MOA)의 메커니즘을 해명 하는 것이 중요. 그러나, 이러한 식물 defensins MOA 제대로 이해 하 고. 현재 증거 그들이 다른 MOA^5,6,,78전시 제안 합니다. 일부 defensins extracellularly 버섯에 행동 하 고 특정 세포 벽/플라즈마 막 주민 sphingolipids 대상, 막 무결성 고 세포 독성 경로^9,,1011활성화 됩니다. 그러나 최근에,, 곰 팡이 세포로 이동 하는 항진균 defensins 발견된^12,,1314있다. 일부 이러한 defensins 바인딩할 막 상주 생리 인지질, oligomeric 단지를 형성 하 고 플라즈마 막^15,,1617permeabilize. 따라서, 식물 defensins의 MOA의 몇 가지 측면 해명 되어 있다. 그러나, 식물 defensins 가능성이의 MOA 아직 식별 및 포괄적인 모델에 통합 이벤트의 복잡 한 세트를 포함 한다. 특히, 이러한 펩 티이 드의 셀룰러 목표의 우리의 이해에 큰 간격이 남아 있습니다.

진보와 함께 최근 현미경 검사 법 기술 및 새로운 형광 프로브 개발, 라이브 세포 이미징 기술은 지금 자주 사용 된다 항균 성 펩 티 드 (암페어)의 모아 공부 하. 이러한 기술을 보완 형태에 항진균 펩타이드의 효과 분석 하는 주로 고용 immunolocalization, 전자 현미경, 원자 힘 현미경 또는 x 선 단층 촬영¹⁸등 널리 사용 되는 방법 및 세포 벽 무결성, 원형질 막 permeabilization로 셀 성장/분기 패턴 변경의 연구를 포함 하 여 고 죽이 곰 팡이 세포의 성장. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 연구는 특정 시간 시점에서 셀 defensin 도전 하 응답 그들의 동적 변화를 모니터링 하는 같은 셀에 이미징 시간 경과 수행 하는 대신 펩 티 드와 치료 후 이미징에 국한 되었습니다. 최근 몇 년 동안, 라이브 셀 이미징 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 함께에서 붙일 레이블된 펩 티 드의 사용은 앰프-미생물 상호 작용의 역동성의 실시간 시각화를 활성화 하 고. 둘 다 자연스럽 게 정화 하 고 화학적으로 합성된 항진균 펩 티 드 형광 라벨 태그 될 수 있습니다 (예를 들어, DyLight, rhodamine, BODIPY, 또는 알 렉 사 Fluor 기반 염료) 직접 세포와의 상호 작용 하는 동안 시간 경과 의해 관찰 하 고 라이브 셀 이미지입니다. 이러한 펩 티 드를 표시의 사용은 크게 모드 항목, subcellular 지 방화, 세포내 매매, 및 살아있는 곰 팡이 세포 ^{내 항진균 작업의 사이트를 포함 하 여 그들의 MOA의 다양 한 측면의 우리의 이해를 증가 18}.

최근, 여러 연구 공장 defensins 포함 하는 다양 한 항진균 펩 티 드는 살고 곰 팡이 세포^12,14,,1920내 면 나타났습니다. 이러한 defensins 가능성이의 MOA 세포내 목표와 상호 작용을 포함 한다. 우리 최근 두 ascomycete 버섯, Neurospora crassa 과 Fusarium graminearum에 MtDef4 defensin 식물의 항진균 액션을 보고 있다. MtDef4 곰 팡이 셀 항목 및이 균¹⁴subcellular 지 방화에 대 한 다른 경로 사용 하 여 표시 했다. 화학적으로 사용이 연구 합성 tetramethyl rhodamine (TAMRA)-중요 한 형광 염료 (막 선택적 염료, FM4-64; 막 permeant 염료, SYTOX 그린 셀 죽음 기자 염료, 요오드 화물 propidium)와 함께에서 MtDef4를 표시 하 고 신진 대사 억제제입니다. 이러한 분석의 MtDef4, 세포내 수송의 그것의 기계 장치 및 그것의 subcellular 대상¹⁴의 국제화 활동을 보여주었다.

여기, confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 셀 이미징에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 프로토콜 공장 defensin 곰 팡이 상호 작용, 특히 공부를 중요 한 형광 염료, 전 좌의 경로와 defensins 곰 팡이 세포에서의 세포내 표적 조합에 붙일 레이블된 펩 티 드를 이용 한다.

Protocol

1. 라벨 Defensins Fluorophores와의 살아있는 세포 내부에 항균 성 속성으로 이해 및 지역화 defensin의 최소 효과가 fluorophore를 선택 합니다.참고: 최적의 fluorophore 선택 특정 실험 목적에 따라 달라 집니다. 스펙트럼 및 화학 속성, photostability, 크기와는 fluorophore의 충전도 고려해 야 합니다. 라벨 라벨 키트 상업용 공급 업체에서 제공 하는 적절 한 펩 티 드를 사용 하 여 선택한 fluorophore?…

Representative Results

라이브 셀 이미징 추적 하 고 국제화 및 두 defensins, MtDef4 및 MtDef5, 개자리속 truncatula;에서 subcellular 지 방화 비교 실시 되었다 버섯 모양 세포. TMR MtDef4 MtDef5 Dylight550으로 표시 했습니다 동안 합성 화학적으로 되었다 (Dylight550-MtDef5). Conidia 막 선택적 염료 FM4-64와 함께에서 어느 defensin 함께 알을 품을 했다. 그림 1 TMR MtDef4가 다른 밀매 경로 N. cra…

Discussion

이 연구에 붙일 레이블된 항진균 defensins 사용 하 여 신뢰할 수 있는 라이브 셀 이미징 방법론 곰 팡이 세포에 이러한 펩 티이 드의 국제화의 속도 론을 공부 하 고 그들의 subcellular 목표를 결정 하는 설명 했다. 이 방법은 일시적으로 그리고 공간 defensins와 곰 팡이 세포 사이 상호 작용의 역동성을 시각화 하는 강력한 도구입니다.

다양 한 방법은 국제화 식물 defensins 곰 팡이 세?…

Materials

FM4-64 Dye	Life Technologies	T13320
DyLight 550 Antibody Labeling Kit	Thermo Scientific	84530
Glass Bottom Microwell Dishes	Mat TeK	P35G-1.5-10-C
Mira cloth	EMD Millipore Corp	475855-1R
SP8-X confocal microscope	Leica
ImageJ software	FiJi		For Image analysis
Imaris software	Bitplane		For Image analysis