Imagem latente da viver-pilha de células fúngicas para investigar os modos de entrada e localização Subcellular da planta antifúngico defensinas
Summary
Defensinas de plantas desempenham um papel importante nas defesas vegetais contra patógenos. Para uma utilização eficaz destes peptides antifúngicos como agentes antifúngicos, compreender seus modos de ação (MOA) é crítica. Aqui, um método de imagem de viver-pilha é descrito para estudar aspectos críticos do MOA destes peptides.
Abstract
Pequenas rica em cisteína defensinas são um dos maiores grupos de péptidos de defesa do hospedeiro presentes em todas as plantas. Muitos defensinas de plantas apresentam potente em vitro atividade antifúngica contra um amplo espectro de patógenos fúngicos e, portanto, têm o potencial para ser usado como agentes antifúngicos em culturas transgénicas. Para aproveitar todo o potencial de defensinas de plantas para controle de doenças, é crucial para elucidar seus mecanismos de ação (MOA). Com o advento de técnicas avançadas de microscopia, imagem latente da viver-pilha tornou-se uma poderosa ferramenta para a compreensão da dinâmica da MOA antifúngico de defensinas de plantas. Aqui, um método de imagem de microscopia confocal com base viver-pilha é descrito usando dois defensinas de plantas fluorescente etiquetadas (MtDef4 e MtDef5) em combinação com corantes fluorescentes vitais. Esta técnica permite a visualização em tempo real e análise dos eventos dinâmicos da internalização de MtDef4 e MtDef5 em células fúngicas. Importante, neste ensaio gera uma riqueza de informações, incluindo cinética da internalização, modo de entrada e Localização subcellular destes peptides. Juntamente com outras ferramentas de célula biológica, estes métodos fornecidos críticos insights sobre a dinâmica e a complexidade da MOA destes peptides. Essas ferramentas também podem ser usadas para comparar o MOA destes peptides contra fungos diferentes.
Introduction
As plantas desenvolveram um sofisticado sistema imune inato para defesa contra o de patógenos microbianos planta1. Expressam numerosos péptidos de defesa anfitrião gene codificado com atividade antimicrobiana putativo2. De fato, muitos destes peptides exibem atividade antimicrobiana em vitro3. Defensinas compõem um dos maiores grupos de peptídeos de defesa do hospedeiro no Reino planta4. Estes peptídeos ricos em cisteína, catiônicos apresentam atividade inibitória do crescimento potentes contra fungos e patógenos oomiceto em concentrações micromolar e representam uma das primeiras linhas de defesa contra estes patógenos5,6. Por causa da sua potente atividade antifúngica, defensinas podem ser exploradas em aplicações agribiotechnological para gerar culturas resistentes a doenças. Superexpressão constitutiva de várias defensinas de plantas foi mostrado para aumentar a resistência a doenças nos testes de campo e estufa de culturas transgénicas6. É importante desvendar os mecanismos de ação (MOA) estes peptides antifúngicos para aproveitar totalmente o seu potencial como instrumentos eficazes de proteção de cultivos. No entanto, o MOA de defensinas estas plantas é mal compreendido. Evidência atual sugere que eles apresentam diferentes MOA5,6,7,8. Algumas defensinas atuam extracelularmente sobre fungos e alvo específico da parede celular/plasma membrana residente esfingolipídeos, romper a integridade da membrana e ativar vias de toxicidade celular9,10,11. Recentemente, no entanto, defensinas antifúngicas que translocar em células fúngicas foram descobertos12,13,14. Alguns destes defensinas ligam para bioativos fosfolipídios da membrana-residente, formam complexos oligoméricos e permeabilize membranas de plasma15,16,17. Assim, alguns aspectos do MOA de defensinas de plantas têm sido elucidados. No entanto, o MOA de planta defensinas prováveis envolve um conjunto complexo de eventos que ainda não foram identificados e integrados em um modelo abrangente. Em particular, ainda há uma importante lacuna em nossa compreensão dos alvos celulares destes peptides.
Com os recentes avanços em tecnologias de microscopia e o desenvolvimento de novas sondas fluorescentes, técnicas de imagem live-célula agora são frequentemente usadas para estudar o MOA de peptídeos antimicrobianos (AMPs). Estas técnicas complementam métodos amplamente utilizados como immunolocalization, microscopia eletrônica de varredura, microscopia de força atômica ou tomografia computadorizada de raios-x18, que têm sido empregados principalmente para analisar os efeitos de peptídeos antifúngicos na morfologia e crescimento de células fúngicas, incluindo o estudo da integridade da parede celular, alterações nos padrões de crescimento/ramificação de célula, bem como a permeabilização da membrana plasmática e matando. No entanto, estes estudos foram limitados para células em um certo ponto do tempo de imagem após o tratamento com os peptídeos em vez de executar o lapso de tempo de imagens sobre as mesmas células para monitorar suas mudanças dinâmicas em resposta ao desafio de defensina. Nos últimos anos, uso de peptídeos fluorescente etiquetados em conjunto com células vivas de imagem utilizando microscopia confocal tem permitido a visualização em tempo real da dinâmica de interações de AMP – micróbio. Ambos naturalmente purificado e quimicamente sintetizados peptídeos antifúngicos podem ser marcados com etiquetas fluorescentes (por exemplo, DyLight, rodamina, BODIPY ou Alexa Fluor baseado corantes) e diretamente observado durante sua interação com células do lapso de tempo imagem latente da viver-pilha. A utilização destas rotulado peptídeos aumentou significativamente a nossa compreensão dos diferentes aspectos do seu MOA, incluindo o modo de entrada, Localização subcellular, tráfico intracelular e sítios de ação antifúngica dentro de células fúngicas vivas 18.
Recentemente, vários estudos têm mostrado que vários peptídeos antifúngicos incluindo planta defensinas são internalizados por viver células fúngicas12,14,19,20. O MOA destas defensinas prováveis envolve interação com alvos intracelulares. Recentemente informamos a ação antifúngica de uma planta defensina MtDef4 em dois fungos ascomicetes, Neurospora crassa e Fusarium graminearum. MtDef4 foi mostrado para usar caminhos diferentes para a entrada de célula fúngica e Localização subcellular nestes fungos14. Este estudo usado quimicamente sintetizado tetrametil rodamina (TAMRA)-rotulado MtDef4 em combinação com corantes fluorescentes vitais (tintura de membrana-permeant, SYTOX verde, a tintura de membrana seletiva, FM4-64; a tintura de repórter de morte celular, iodeto de propidium) e inibidores metabólicos. Essas análises demonstraram a cinética da internalização da MtDef4, seus mecanismos de transporte intracelular e seus alvos subcellular14.
Aqui, um protocolo para a imagem latente de viver-pilha usando microscopia confocal é apresentado. O protocolo utiliza péptidos fluorescente etiquetados em combinação com corantes fluorescentes vitais para estudar interações defensina-fungos vegetais, em particular, as vias de translocação e os alvos intracelulares de defensinas em células fúngicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, uma metodologia de viver-pilha confiável de imagens com o uso da fluorescente etiquetadas defensinas antifúngicas foi descrita para estudar a cinética da internalização destes peptides em células fúngicas e determinar os alvos subcellular. Este método é uma ferramenta poderosa para visualizar a dinâmica da interação entre defensinas e células fúngicas, temporal e espacialmente.
Vários métodos têm sido usados para estudar a internalização e localização intrace…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Dr. R. Howard Berg, diretor do centro de microscopia integrado com o Donald Danforth Plant Science Center, para sua orientação e ajuda com microscopia confocal. Os autores não têm nenhum conflito de interesses para declarar.
Materials
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
References
- Jones, J. D. G., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).
- Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).
- Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides. Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).
- Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. Plant defensins: Common fold, multiple functions. Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).
- De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides. Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).
- Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants?. Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).
- Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production. Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).
- Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications. ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).
- Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics. Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).
- Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins. Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).
- Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).
- Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae. J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).
- Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle. Biochemistry. 46 (4), 987-996 (2007).
- El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum. Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).
- Baxter, A. A., et al. The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis. Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).
- Kvansakul, M., et al. Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).
- Poon, I. K. H., et al. Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis. eLife. 3, e01808 (2014).
- Muñoz, A., Read, N. D. Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action. Front. Immunol. 3, 248 (2012).
- Hayes, B. M. E., et al. Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).
- Muñoz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26. Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).
- Eaton, C. J., et al. The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through Gα proteins in Neurospora crassa. PLoS One. 7 (10), e48026 (2012).
- Leslie, J. F., Summerell, B. A. . The Fusarium. laboratory manual. , (2006).
- Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. An automated quantitative assay for fungal growth inhibition. FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).
- Sagaram, U. S., et al. Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry. PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).
- Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).
- Nair, R., et al. Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information. Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).
- Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. Refining protein subcellular localization. PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66 (2005).
- Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging. Sci. Rep. 7, 43542 (2017).
