लाइव-कवक कोशिकाओं के सेल इमेजिंग प्रवेश के साधनों की जांच करने के लिए और रोधी संयंत्र Defensins के उपसेलुलर स्थानीयकरण
Summary
संयंत्र defensins रोगजनकों के खिलाफ संयंत्र रक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । रोधी एजेंटों के रूप में इन रोधी पेप्टाइड्स के प्रभावी उपयोग के लिए, (मुआ) कार्रवाई के अपने मोड को समझना महत्वपूर्ण है । यहां, एक जीवित सेल इमेजिंग विधि इन पेप्टाइड्स के मुआ के महत्वपूर्ण पहलुओं का अध्ययन करने के लिए वर्णन किया गया है ।
Abstract
छोटे cysteine-रिच defensins सभी संयंत्रों में मौजूद मेजबान रक्षा पेप्टाइड्स के सबसे बड़े समूहों में से एक हैं । कई संयंत्र defensins इन विट्रो में शक्तिशाली कवक रोगज़नक़ों के एक व्यापक स्पेक्ट्रम के खिलाफ विरोधी गतिविधि प्रदर्शन और इसलिए ट्रांसजेनिक फसलों में रोधी एजेंटों के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है । रोगों के नियंत्रण के लिए संयंत्र defensins की पूरी क्षमता का दोहन करने के लिए, यह (मुआ) कार्रवाई के अपने तंत्र स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है । उन्नत माइक्रोस्कोपी तकनीक के आगमन के साथ, लाइव सेल इमेजिंग संयंत्र defensins की रोधी मुआ की गतिशीलता को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है. यहां, एक फोकल माइक्रोस्कोपी आधारित लाइव सेल इमेजिंग विधि दो फ्लोरोसेंट लेबल संयंत्र defensins महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंजक के साथ संयोजन में (MtDef4 और MtDef5) का उपयोग कर वर्णन किया गया है । इस तकनीक को वास्तविक समय दृश्य और कवक कोशिकाओं में MtDef4 और MtDef5 internalization की गतिशील घटनाओं के विश्लेषण में सक्षम बनाता है । महत्वपूर्ण बात, इस परख internalization कैनेटीक्स, प्रवेश के मोड और इन पेप्टाइड्स के उपसेलुलर स्थानीयकरण सहित जानकारी का खजाना उत्पंन करता है । अंय सेल जैविक उपकरणों के साथ, इन तरीकों गतिशीलता और इन पेप्टाइड्स के मुआ की जटिलता में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है । इन उपकरणों को भी विभिंन कवक के खिलाफ इन पेप्टाइड्स के मुआ तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
पौधों माइक्रोबियल संयंत्र के खिलाफ रक्षा के लिए एक परिष्कृत जंमजात प्रतिरक्षा प्रणाली विकसित किया है1। वे ख्यात रोगाणुरोधी गतिविधि के साथ कई जीन इनकोडिंग होस्ट रक्षा पेप्टाइड्स एक्सप्रेस2. दरअसल, इन पेप्टाइड्स के कई विट्रो मेंरोगाणुरोधी गतिविधि प्रदर्शन3. Defensins संयंत्र किंगडम4में मेजबान रक्षा पेप्टाइड्स के सबसे बड़े समूहों में से एक शामिल हैं । इन cysteine-रिच, cationic पेप्टाइड्स micromolar सांद्रता पर कवक और oomycete रोगजनकों के खिलाफ शक्तिशाली विकास निरोधात्मक गतिविधि का प्रदर्शन और इन रोगजनकों के खिलाफ रक्षा की पहली लाइनों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं5,6. उनके शक्तिशाली रोधी गतिविधि के कारण, defensins रोग प्रतिरोधी फसलों उत्पन्न करने के लिए agribiotechnological अनुप्रयोगों में शोषण किया जा सकता है । कई संयंत्र defensins के गठन के एक्सप्रेस ग्रीनहाउस और ट्रांसजेनिक फसलों के क्षेत्र परीक्षण में रोग प्रतिरोध को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है6. यह कार्रवाई के तंत्र को सुलझाना महत्वपूर्ण है (मुआ) इन रोधी पेप्टाइड्स की फसल संरक्षण के लिए प्रभावी उपकरण के रूप में पूरी तरह से अपनी क्षमता का दोहन करने के लिए । हालांकि, इन प्लांट defensins के मुआ खराब समझ रहे हैं । वर्तमान सबूत पता चलता है कि वे अलग मुआ5प्रदर्शन,6,7,8। कुछ defensins अधिनियम कवक पर extracellularly और लक्ष्य विशिष्ट कोशिका दीवार/प्लाज्मा झिल्ली निवासी sphingolipids, बाधा झिल्ली अखंडता और सक्रिय सेलुलर विषाक्तता रास्ते9,10,11. हाल ही में, तथापि, रोधी defensins कि कवक कोशिकाओं में translocate की खोज की गई है12,13,14। इनमें से कुछ defensins झिल्ली के लिए बांध-निवासी फॉस्फोलिपिड, फार्म oligomeric परिसरों और permeabilize प्लाज्मा झिल्ली15,16,17। इस प्रकार पादप defensins के मुआ के कुछ पहलुओं का आविर्भाव हुआ है. हालांकि, संयंत्र defensins की संभावना मुआ की घटनाओं की एक जटिल सेट शामिल है जो अभी तक नहीं पहचाना गया है और एक व्यापक मॉडल में एकीकृत । विशेष रूप से, इन पेप्टाइड्स के सेलुलर लक्ष्यों की हमारी समझ में एक प्रमुख अंतर रहता है ।
सूक्ष्म प्रौद्योगिकियों में हाल ही में प्रगति और नए फ्लोरोसेंट जांच के विकास के साथ, लाइव सेल इमेजिंग तकनीक अब अक्सर रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (AMPs) के मुआ अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है । इन तकनीकों immunolocalization, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी या एक्स-रे टोमोग्राफी के रूप में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों के पूरक हैं, जो ज्यादातर को आकृति विज्ञान पर रोधी पेप्टाइड्स के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए नियोजित किया गया है और कोशिका दीवार अखंडता के अध्ययन सहित कवक कोशिकाओं के विकास, सेल विकास में परिवर्तन/शाखाकरण पैटर्न, साथ ही प्लाज्मा झिल्ली permeabilization और हत्या. फिर भी, इन अध्ययनों से एक निश्चित समय बिंदु पर समय-चूक इमेजिंग करने के लिए defensin चुनौती के जवाब में उनके गतिशील परिवर्तन की निगरानी करने के लिए एक ही कक्ष पर प्रदर्शन के बाद पेप्टाइड्स के साथ उपचार के बाद इमेजिंग कक्षों तक सीमित किया गया है । हाल के वर्षों में, लाइव सेल इमेजिंग के साथ संयोजन के रूप में फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर वास्तविक समय दृश्य सक्षम है AMP की गतिशीलता-सूक्ष्म बातचीत । दोनों स्वाभाविक रूप से शुद्ध और रासायनिक संश्लेषित रोधी पेप्टाइड्स फ्लोरोसेंट लेबल के साथ टैग किया जा सकता है (जैसे, DyLight, rhodamine, BODIPY, या Alexa Fluor आधारित रंजक) और सीधे समय से कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत के दौरान मनाया चूक लाइव सेल इमेजिंग । इन लेबल किए गए पेप्टाइड्स के उपयोग से उनके मुआ के विभिन्न पहलुओं की समझ काफी बढ़ गई है, जिनमें प्रवेश की विधा, उपसेलुलर स्थानीयकरण, intracellular की तस्करी, और जीवित कवक कोशिकाओं के भीतर रोधी कार्रवाई की साइटें शामिल हैं 18.
हाल ही में, कई अध्ययनों से पता चला है कि संयंत्र defensins सहित विभिंन रोधी पेप्टाइड कवक कोशिकाओं12,14,19,20के रहने से आंतरिक हैं । इन defensins की मुआ की संभावना intracellular लक्ष्यों के साथ बातचीत शामिल है । हमने हाल ही में दो ascomycete कवक, Neurospora crassa और फ़्यूज़ेरियम graminearumमें MtDef4 defensin संयंत्र की रोधी कार्रवाई की सूचना दी है । MtDef4 फफूंद सेल प्रवेश और इन कवक में सेलुलर स्थानीयकरण के लिए अलग रास्ते का उपयोग करने के लिए दिखाया गया था14। इस अध्ययन रासायनिक संश्लेषित tetramethyl rhodamine (तमृ) का इस्तेमाल किया-महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंगों के साथ संयोजन में लेबल MtDef4 (झिल्ली चयनात्मक डाई, FM4-64; झिल्ली-permeant डाई, SYTOX ग्रीन; द सेल डेथ रिपोर्टर डाई, propidium आयोडाइड) और चयापचय अवरोधकों । इन विश्लेषणों ने MtDef4 के internalization के कैनेटीक्स का प्रदर्शन किया, intracellular परिवहन के अपने तंत्र और उसके उपसेलुलर लक्ष्य14.
यहां, लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का उपयोग कर फोकल माइक्रोस्कोपी प्रस्तुत की है । प्रोटोकॉल का इस्तेमाल फ्लोरोसेंट महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट के साथ संयोजन में पेप्टाइड्स लेबल का उपयोग करने के लिए संयंत्र defensin-फंगल बातचीत का अध्ययन, विशेष रूप से, translocation के रास्ते और कवक कोशिकाओं में defensins के intracellular लक्ष्य ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, फ्लोरोसेंट लेबल रोधी defensins के उपयोग के साथ एक विश्वसनीय लाइव सेल इमेजिंग पद्धति को फफूंद कोशिकाओं में इन पेप्टाइड्स के internalization के कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए और अपने उपसेलुलर लक्ष्य निर्ध?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ आर हावर्ड बर्ग, डोनाल्ड Danforth संयंत्र विज्ञान केंद्र में एकीकृत माइक्रोस्कोपी सुविधा के निदेशक, उनके मार्गदर्शन के लिए और फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ मदद के लिए धन्यवाद । लेखकों के हितों की घोषणा करने का कोई विरोध नहीं है.
Materials
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
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