מידול עמילואיד-β42 רעילות, הקשורים ניוון מוחיים במוח דג זברה למבוגרים
Summary
פרוטוקול זה מתאר את סינתזה אפיון, הזרקה של פפטידים עמילואיד monomeric-β42 ליצירת עמילואיד רעילות של דג זברה בוגרת כדי ליצור מודל של מחלת אלצהיימר, ואחריו ניתוחים היסטולוגית וזיהוי של הסיכומים.
Abstract
מחלת אלצהיימר (AD) היא מתישה מחלות ניווניות איזה הצטברות עמילואיד רעיל-β42 פפטידים (Aβ42) מוביל ניוון סינפטית, דלקת, מוות עצביים, למידה גירעונות. בני אדם לא יכול להתחדש נוירונים אבוד במקרה של המודעה בחלקו בשל קיבולת proliferative לקוי של תאי גזע עצביים/קדמון (NSPCs) ושל נוירוג’נסיס מופחת. לכן, טיפולים משובי יעיל צריך גם לשפר את ההתפשטות neurogenic קיבולת של NSPCs-דג זברה (רזבורה rerio) הוא יצור משובי ואני נוכל ללמוד את התוכניות מולקולרי בסיסי שבו היינו יכולים לעצב גישות טיפוליות כדי להתמודד עם AD. מסיבה זו, הדור של דגם AD-כמו בדג זברה היה הכרחי. באמצעות המתודולוגיה שלנו, אנחנו יכולים להציג נגזרות סינתטי של פפטיד Aβ42 עם יכולת חדירה לרקמות לתוך המוח דג זברה למבוגרים, ולנתח המחלה פתולוגיה ואת התגובה משובי. היתרון מעל שיטות קיימות או בבעלי חיים הוא שדג זברה הזאת יכולה ללמד אותנו איך מוח חוליות יכול להתחדש באופן טבעי, ובכך לסייע לנו להתייחס מחלות ניווניות אנושי טוב יותר על ידי מיקוד NSPCs אנדוגני. לפיכך, המודל עמילואיד רעילות הוקמה במוח דג זברה למבוגרים עשוי להיפתח דרכים חדשות למחקר בתחום של מדעי המוח, רפואה קלינית. בנוסף, ביצוע פשוט בשיטה זו מאפשר הערכת ניסיוני חסכונית ויעילה. כתב יד זה מתאר את סינתזה של הזרקה של פפטידים Aβ42 למוח דג זברה.
Introduction
המודעה היא מחלה פרוגרסיבית כרונית המאופיינת על ידי האובדן של נוירונים, synapses קליפת המוח1,2,3,4,5. גולת neuropathological הקלאסית של AD הן בתצהיר של פפטידים עמילואיד וסבך היווצרות neurofibrillary (NFTs)6. שלטי סנילי, הידוע גם בשם עמילואיד הפלאק, מורכבים של פפטידים עמילואיד-β (Aβ) שיוצרים מבנים קפלים β parenchyma המוח5. ההצטברות של Aβ42 בחולים לספירה יש תפקיד מוקדם וקריטיים התקדמות המחלה. המודעה מפעילה מפל של האירועים שהובילו סינפטית בתפקוד לקוי פלסטיות, אובדן עצביים7,8,9,10.
המוח למבוגרים של דג זברה teleost משמש מודל מצויין ללמוד ברגולציה של תאי גזע פלסטיות11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 ומחלות שונות במערכת העצבים המרכזית (CNS), לרבות לספירה21,22,23 ,24. בשל מגוון רחב של שיטות נסיוניות זמין19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, מחקרים אלה הן אינפורמטיבי ריאלי. דג זברה יכול לחדש את מערכת העצבים המרכזית13,15,32,33,34,35,36,37, 38, בין השאר באמצעות תוכניות מולקולרי מופעל לאחר אובדן עצביים19,39,40,41,42,43, 44. לכן, קביעת מודל מחלות ניווניות דג זברה יכול לעזור כתובת הרומן שאלות הנוגעות משובי יכולת גזע ביולוגיה של התא במוח חוליות.
לאחרונה, פיתחנו מודל רעילות עמילואיד במוח דג זברה למבוגרים באמצעות הזרקת Aβ42 סינתטי פפטידים (טבלה 1)39. זריקה זו גרמה הקשורים ניוון מוחיים פנוטיפים מזכיר הפתולוגיה במוח האנושי (למשלמוות של תאים, microglial הפעלה, ניוון סינפטית, גירעונות זיכרון), המציין את דג זברה יכול לשמש עבור העלאת הקשורים ניוון מוחיים במוח דג זברה, Aβ42 פפטידים יכולים להתגלות עם immunohistochemical stainings, המנגנונים המולקולריים של התחדשות של דג זברה בוגרת ש-CNS יכול להיות מזוהה39. ב פרוטוקול זה, נדגים ההזרקה של peptides סינתטי עמילואיד למוח דג זברה באמצעות של cerebroventricular הזרקה (CVMI) שיטה27,39,45,46 כדי לחקות את התצהיר עמילואיד (איור 1). CVMI מספק דרך מקורית להעביר את פפטידים, אשר צבירה בעת הזרקת כמבני β-גיליון ולעשות מאמץ רעילות. פפטידים מפוזרים באופן אחיד ברחבי המוח, פילוח האזור חדרית לאורך כל ציר rostro-סימטרית45. בנוסף, שיטה זו מאפשרת ניתוח התגובה מולקולרית מורפולוגיים של NSPCs במוח דג זברה בוגרת בעקבות תכלילים עמילואיד. מחקרים כאלה תספק לנו תובנה עבור תיקון מוצלח המוח ביונקים. השיטה שלנו יכול לשמש כדי להבין את המנגנון המולקולרי הכרחי של תגובה התחדשות מוצלחת אחרי לספירה תסמינים לזירוז חידוש המלאי של נוירונים לאיבוד שחזור פונקציונלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתן לשנות את פפטידים עמילואיד שיכלול וריאציות ברצף או תגיות שונות. למשל, מקושקשות פפטיד עמילואיד יכול להיווצר, פפטידים יכול להיות המסומנות בתגי פלורסנט-קצה אמיני של הסוף פפטיד או מתויג עם פפטידים נושאת39. באופן דומה, פרוטוקול זה, הינו פפטיד נושאת חודר לתא פפטיד TR בגלל היעילות …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי DZNE, האגודה הלמהולץ (VH-NG-1021), CRTD, ט ו דרזדן (FZ-111, 043_261518) ולאחר DFG (KI1524/6) (סי. קיי); על ידי לייבניץ ההתאגדות (ראה-2011-IPF-2) ו BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). כן נרצה להודות אולריקה הופמן פפטיד סינתזה, וכדי נאנדיני אשוקה, Prayag Murawala וטאנאקה אלי לעזרה במהלך הצילומים ההליך.
Materials
| Fmoc-protected amino acids | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1030 | Activator |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1180 | Racemization supressor |
| N,N-Diisopropylethylamine | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-003 | Base |
| Dimethylformamide | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-004 | Solvent |
| N-Methylmorpholine | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany | A12158 | Base |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidine | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 822299 | Fmoc deprotection reagent |
| Dichlormethane (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 106050 | Solvent |
| Formic acid (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 100264 | Buffer component for HPLC |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 808260 | Clevage Mixture reagent |
| Triisopropylsilane(TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 233781 ALDRICH | Clevage Mixture reagent |
| Acetonitrile (for UPLC/LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Solvent |
| Acetonitrile (for HPLC) | VWR International Ltd, England | 83639.320 | Solvent |
| Diethylether | VWR International Ltd, England | 23811.326 | Solvent for peptide precipitation |
| Dithiotritol (DTT) | VWR International Ltd, England | 0281-25G | Clevage Mixture reagent |
| TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) | S30023 | Solid phase for SPPS |
| Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters | Intavis AG (Cologne, Germany) | 34.274 | Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 11806-50-N | Filteration of precipitated peptides |
| Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | Pre-filteration for HPLC |
| Peptide Synthesizer | Intavis, Cologne, Germany | ResPep SL | Automated solid-phase peptide synthesizer |
| Water Alliance HPLC | Waters, Milford Massachusetts, USA | Waters 2998, Waters e2695 | Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC) |
| PolymerX, bead size 10μm, 250×10 mm | Phenomenex Ltd. Germany | 00G-4328-N0 | Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column |
| Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA | LCPAK0001 | Water purification system |
| Filtration Unit | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 16307 | Filtration unit for peptide precipitation |
| UPLC Aquity with UV Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | M09UPA 664M | Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50×2.1 mm | Waters, Milford Massachusetts, USA | 186002350 | Analytical C18 column |
| ACQUITY TQ Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | QBB908 | Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany | 16706, 101542 | Lyophilizer with vaccum pump |
| Paradigm plate reader | Beckman Coulter | ||
| MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 821.472 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| Needle | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | |
| Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| Cryostat | Leica | CM1950 |
References
- LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Selkoe, D. J. Alzheimer’s disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
- Serpell, L. C. Alzheimer’s amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
- Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer’s disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer’s disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
- Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer’s disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
- Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer’s disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
- McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
- Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer’s disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
- Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
- Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
- Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer’s disease?. Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
- Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer’s disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
- Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
- Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
- Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
- Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
- Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
- Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
- Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
- Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
- Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
- Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
- Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Katz, S., et al. . Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
- Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073 (2015).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Sewald, N., Jakubke, H. . Peptides: Chemistry and Biology. , (2009).
- Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chemistry. 22 (25), 8685-8693 (2016).
- Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
- Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
- Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
- Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).
