Моделирование амилоид β42 токсичности и нейродегенеративные в мозге взрослого данио рерио
Summary
Этот протокол описывает синтеза, характеристика и инъекции мономерных амилоид β42 пептидов для генерации амилоида токсичности в взрослых рыбок данио создать модель болезни Альцгеймера, следуют гистологического анализа и обнаружения агрегатов.
Abstract
Болезнь Альцгеймера (AD) — изнурительных нейродегенеративных заболеваний, в котором накопление токсичных амилоид β42 пептидов (Aβ42) приводит к синаптических дегенерации, воспаление, нейронов смерть и обучения дефицита. Люди не регенерировать потерянные нейронов в случае объявления в части из-за нарушения пролиферативной способности нервных стволовых/прогениторных клеток (NSPCs) и снижение нейрогенез. Таким образом эффективный регенеративной терапии следует также расширять распространение и нейрогенных емкость NSPCs. данио рерио (Danio рерио) регенеративный организм, и мы можем узнать основные молекулярные программы, с которыми мы могли бы дизайн терапевтические подходы к решению AD. По этой причине необходимо поколения модель AD-как в данио рерио. С помощью нашей методологии, мы можем ввести синтетические производные Aβ42 пептид с проникающей способностью ткани в мозге взрослого данио рерио и анализировать заболевания патология и восстановительной реакции. Преимуществом над существующими методами или Животные модели является то что у рыбок данио могут научить нас, как позвоночных мозг может естественно регенерации и тем самым помочь нам для лечения человека нейродегенеративные заболевания лучше по ориентации эндогенного NSPCs. Таким образом модель амилоид токсичность, в головном мозге взрослых рыбок данио могут открыть новые возможности для исследований в области нейробиологии и клинической медицины. Кроме того простое выполнение этого метода позволяет для затратоэффективной и действенной экспериментальной оценки. Эта рукопись описывает синтеза и инъекции Aβ42 пептидов в zebrafish мозга.
Introduction
AD-это хроническое прогрессирующее заболевание, характеризующееся потерей нейронов и синапсы в коре1,2,3,4,5. Классическая патологического отличительными чертами AD являются отложением амилоида пептидов и формирования нейрофибриллярных связок (NFTs)6. Старческий таблички, также известный как амилоидных бляшек, состоят из пептидов амилоид β (значения), образующих β-плиссе структур в паренхиме мозга5. Накопление Aβ42 в больных ад имеет раннего и решающую роль в болезни. AD запускает каскад событий, приведших к синаптических дисфункции, нарушение пластичности и нейрональных потери7,8,9,10.
Взрослого мозга костистых данио рерио служит прекрасной моделью для изучения регуляции стволовых клеток пластичности11,12,13,14,15, 16,17,18,,1920 и различных заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), включая объявление21,22,23 ,24. Из-за широкий спектр доступных экспериментальные методы19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, эти исследования являются информативными и осуществимым. Данио рерио может пополнить ЦНС13,15,,3233,34,35,36,37, 38, частично с помощью молекулярных программ активируется после нейрональных потери19,39,40,41,,4243, 44. Таким образом создание модели нейродегенеративные заболевания в zebrafish может помочь адрес Роман вопросы относительно регенеративной способности и стволовых клеток биологии позвоночных мозги.
Недавно мы разработали модель амилоида токсичности в мозге взрослого данио рерио путем инъекций синтетических Aβ42 пептидов (Таблица 1)39. Это инъекции вызвало нейродегенеративные фенотипов напоминает патологии мозга человека (например, смерть клетки, микроглии активации, синаптических дегенерация и дефицита памяти), указав, что у рыбок данио могут быть использованы для выявления нейродегенеративные в мозге данио рерио, Aβ42, пептиды могут быть обнаружены с stainings иммуногистохимии и молекулярные механизмы регенерации в взрослых рыбок данио, ЦНС могут быть определены39. В этом протоколе мы демонстрируем инъекции синтетических пептидов амилоида в мозг данио рерио, с помощью которых инъекции (CVMI) метод27,,3945,46 для имитации осаждения амилоида (рис. 1). CVMI предоставляет новый способ доставки пептиды, которые совокупности после инъекции как β-лист структур и оказывать токсическое воздействие. Пептиды распределяются равномерно по всему мозгу, ориентация желудочков район вдоль всей rostro хвостового оси45. Кроме того этот метод позволяет для анализа морфологических и молекулярной реакции NSPCs в мозге взрослого данио рерио, после амилоида включений. Такие исследования даст нам представление для ремонта успешной мозга млекопитающих. Наш метод может использоваться для понимания необходимости молекулярный механизм успешной регенерации ответ после AD-подобные симптомы побудить пополнения потеряли нейронов и функциональное восстановление.
Protocol
Representative Results
Discussion
Амилоида пептиды могут быть изменены для включения изменения последовательности или различные теги. К примеру кинулись амилоида пептид может быть создан, и пептиды могут быть помечены флуоресцентные метки в N-terminus конца пептид или отмеченных перевозчик пептиды39. Аналогич…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана DZNE и Гельмгольца (VH-NG-1021), КГПОГ, ту Дрезден (ФЗ-111, 043_261518) и DFG (KI1524/6) (C.K.); Лейбница (пила-2011-ОПЗ-2) и BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (ВМФ). Мы также хотели бы поблагодарить Ulrike Hofmann пептидного синтеза, а также Nandini Asokan, Праяг Murawala и Элли Танака за помощь во время съемок процедура.
Materials
| Fmoc-protected amino acids | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1030 | Activator |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1180 | Racemization supressor |
| N,N-Diisopropylethylamine | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-003 | Base |
| Dimethylformamide | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-004 | Solvent |
| N-Methylmorpholine | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany | A12158 | Base |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidine | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 822299 | Fmoc deprotection reagent |
| Dichlormethane (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 106050 | Solvent |
| Formic acid (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 100264 | Buffer component for HPLC |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 808260 | Clevage Mixture reagent |
| Triisopropylsilane(TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 233781 ALDRICH | Clevage Mixture reagent |
| Acetonitrile (for UPLC/LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Solvent |
| Acetonitrile (for HPLC) | VWR International Ltd, England | 83639.320 | Solvent |
| Diethylether | VWR International Ltd, England | 23811.326 | Solvent for peptide precipitation |
| Dithiotritol (DTT) | VWR International Ltd, England | 0281-25G | Clevage Mixture reagent |
| TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) | S30023 | Solid phase for SPPS |
| Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters | Intavis AG (Cologne, Germany) | 34.274 | Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 11806-50-N | Filteration of precipitated peptides |
| Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | Pre-filteration for HPLC |
| Peptide Synthesizer | Intavis, Cologne, Germany | ResPep SL | Automated solid-phase peptide synthesizer |
| Water Alliance HPLC | Waters, Milford Massachusetts, USA | Waters 2998, Waters e2695 | Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC) |
| PolymerX, bead size 10μm, 250×10 mm | Phenomenex Ltd. Germany | 00G-4328-N0 | Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column |
| Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA | LCPAK0001 | Water purification system |
| Filtration Unit | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 16307 | Filtration unit for peptide precipitation |
| UPLC Aquity with UV Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | M09UPA 664M | Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50×2.1 mm | Waters, Milford Massachusetts, USA | 186002350 | Analytical C18 column |
| ACQUITY TQ Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | QBB908 | Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany | 16706, 101542 | Lyophilizer with vaccum pump |
| Paradigm plate reader | Beckman Coulter | ||
| MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 821.472 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| Needle | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | |
| Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| Cryostat | Leica | CM1950 |
References
- LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Selkoe, D. J. Alzheimer’s disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
- Serpell, L. C. Alzheimer’s amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
- Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer’s disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer’s disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
- Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer’s disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
- Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer’s disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
- McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
- Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer’s disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
- Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
- Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
- Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer’s disease?. Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
- Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer’s disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
- Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
- Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
- Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
- Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
- Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
- Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
- Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
- Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
- Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
- Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
- Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Katz, S., et al. . Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
- Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073 (2015).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Sewald, N., Jakubke, H. . Peptides: Chemistry and Biology. , (2009).
- Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chemistry. 22 (25), 8685-8693 (2016).
- Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
- Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
- Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
- Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).
