Met behulp van een aangepast Microfluidic olfactorische Chip voor de beeldvorming van neuronale activiteit in reactie op de feromonen in mannelijke C. Elegans hoofd neuronen
Summary
Het gebruik van een aangepast “olfactorische chip” voor de efficiënte calcium beeldvorming van C. elegans mannetjes wordt hier beschreven. Studies van mannelijke Gasbedwelming met behulp van glycerol en een feromoon worden ook weergegeven.
Abstract
Het gebruik van calcium indicatoren heeft ons begrip van neurale dynamiek en verordening aanzienlijk verbeterd. De nematode Caenorhabditis elegans, met zijn volledig toegewezen zenuwstelsel en transparante anatomie, presenteert een ideaal model voor inzicht in real-time neurale dynamiek calcium indicatoren. Calcium-imaging studies met behulp van deze indicatoren worden in combinatie met microfluidic technologieën en experimentele designs uitgevoerd in zowel gratis voortbewegende en gevangen dieren. Echter hebben de meeste eerdere studies met behulp van vangst apparaten, zoals de olfactorische chip beschreven in Chronis et al., inrichtingen die zijn ontworpen voor gebruik in de meest voorkomende hermafrodiet, zoals het minder vaak mannetje zowel morfologisch en structureel is ongelijke. Een aangepast olfactorische chip is ontworpen en gefabriceerd voor meer efficiëntie bij de mannelijke neuronale imaging met het gebruik van jonge volwassen dieren. Een beurt werd opgenomen in de worm laadhaven haven te draaien van de dieren en voor de scheiding van de individuele neuronen binnen een bilaterale paar in 2D beeldvorming. Wormen zijn blootgesteld aan een gecontroleerde stroom van odorant binnen het microfluidic-apparaat, zoals beschreven in eerdere hermafrodiete studies. Calcium transiënten worden vervolgens geanalyseerd met behulp van de open-sourcesoftware ImageJ. De hierin beschreven procedure ruimte laten voor een verhoogde hoeveelheid mannelijke gebaseerde C. elegans calcium imaging studies, verdiepen ons begrip van de mechanismen van het geslacht wordt bepaald neuronale signalering.
Introduction
Microfluidic apparaten toegenomen toegang bieden tot precies gecontroleerde omgevingen, waarin dieren, zoals de nematode C. elegans, experimenteel gemanipuleerde1kan worden. Deze studies omvatten gedrags testen, calcium beeldvorming studies, of zelfs zeefresten voor specifieke fenotypen, wat resulteert in meer exacte metingen van experimentele resultaten1,2,3,4, 5,6. Microfluidics bieden kleinschalige vloeibare omstandigheden, waardoor gedetailleerde experimenten kunnen worden uitgevoerd tijdens het gebruik te maken van de minimale hoeveelheden van reagentia. Er is een constante productie van nieuwe microfluidic apparaat ontwerpen, en het gebruik van elk varieert, van arenas waarmee voor de natuurlijke sinusvormige motie van C. elegans in behavioral testen en neurale beeldvorming studies, val van apparaten die worden gebruikt in de neurale beeldvorming en olfactorische studies, naar apparaten waarmee voor high-throughput fenotypische analyse in genetische4,5,6,7 schermen. Na de fabricage van een master mold, microfluidic apparaten zijn goedkoop te construeren-gegeven de herbruikbaarheid van de meester — en makkelijk te gebruiken, waardoor snelle gegevens generatie via high-throughput onderzoek. De fabricage van apparaten met behulp van polymeren zoals Polydimethylsiloxaan (PDMS) voorziet in de oprichting van nieuwe apparaten binnen uur.
Calcium imaging studies gebruik genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) uitgedrukt in de doelcellen te meten van de neurale dynamiek van deze cellen in real-time8,9,10,11. Het transparante karakter van C. elegans zorgt voor de opname van de fluorescerende niveaus van deze eiwitten in levende dieren. Traditioneel GECIs is afhankelijk van de groen fluorescente proteïne (GFP)-op basis van sensor GFP-Calmoduline-M13 Peptide (GCaMP), hoewel het meer recente studies hebben deze sensoren voor betere signal-to-noise ratio’s en rood-verschoven excitatie profielen aangepast. Na de ontwikkeling van GCaMP3, eiwitten met deze specificaties zijn gevarieerd, met inbegrip van sensoren zoals GCaMP6s en GCaMP6f (langzame en snelle fluorescentie af-tarieven, respectievelijk), evenals RFP-Calmoduline-M13 Peptide (RCaMP), die heeft een rode-verschoven activering profiel. De combinatie van deze GECIs met C. elegans cel-specifieke gensequenties promotor kan target cellen van belang, met name de sensorische neuronen12,13,14,15 , 16.
Terwijl het gebruiksgemak C. elegans in microfluidic studies blijkt, hebben bijna alle studies gericht op hermafrodieten. Ondanks de mannetjes slechts accounting voor 0.01-0,02% van de bevolking van wild type, onschatbaar bevindingen kunnen voortvloeien uit hun karakterisering. Terwijl de fysieke connectome van de hermafrodiete zenuwstelsel volledig in kaart voor decennia17 gebracht is, nog de mannelijke connectome onvolledig, vooral in de hoofd regio van de dierlijke18. Het gebruik van calcium beeldvorming bij mannen zal bijdragen tot het genereren van een goed begrip van de mannelijke zenuwstelsel en de verschillen die zich tussen de twee geslachten voordoen. De kleinere omvang van C. elegans volwassen mannetjes voorkomt dat effectieve en betrouwbare vangst in de havens van de laden van traditionele olfactorische inrichtingen die zijn ontworpen voor grotere hermafrodieten. Om aan te pakken dit, een gewijzigde versie van de Chronis olfactorische Chip19 werd ontwikkeld met een smaller laden poort, een lagere hoogte van het kanaal, en draait in de worm laden poort (die draaien het dier), waardoor voor de visualisatie van bilaterale links/rechts neuronale paren. Dit ontwerp toelaat: (1) de effectieve overlapping van jonge volwassen mannetjes, (2) een betrouwbaarder oriëntatie van het dier voor de visualisatie van beide leden van bilaterale gepaarde neuronen, en (3) de precieze beeldvorming van neurale activiteit in mannelijke neuronen.
Steeds meer tonen studies aan dat C. elegans mannetjes anders dan hermafrodieten op een verscheidenheid van ascarosides (ascr), of nematode feromonen20,21,22,23 reageren ,24. Daarom, ontwikkeling van een goed begrip van de neurale dynamiek en voorstellingen binnen de mannelijke connectome geworden zelfs meer relevant. Mannelijke C. elegans bevatten 87 geslacht-specifieke neuronen niet aanwezig in de hermafrodiete25,26, wijzigen van de connectome in als-nog onbepaald manieren. Zijnde kundig voor beeld van deze unieke neurale dynamiek zal ons in staat stellen geslacht-specifieke reacties en neurale vertegenwoordigingen beter te begrijpen.
Dit protocol beschrijft het gebruik van een man-aangepast olfactorische chip voor de neurale beeldvorming van mannelijke C. elegans chemosensation. De Nociceptieve neuron die Ash op betrouwbare wijze op 1 M van glycerol in mannetjes, consistent met vorige hermafrodiete reageert bestudeert27. Blootstelling aan ascarosides kan uitlokken reacties die variabele van dier op dier, waarvoor een groter aantal dieren worden getest. De reactie van de man-specifieke CEM neuronen eerder gebleken, via zowel elektrofysiologie en calcium imaging studies, inspelen op variabel ascaroside #323.
Protocol
Representative Results
Discussion
De man-aangepast olfactorische chip integreert een bocht in een smaller laden-poort, waarmee voor meer controle van de oriëntatie en de efficiënte overlapping van mannelijke C. elegans. Dit zorgt voor de visualisatie van zowel de linker- en leden van neuronale bilaterale paren, zonder de behoefte van de z-stapelen. Deze curve leidt tot een oriëntatie uit de buurt van verticale 100% van de tijd in wormen waar slechts een paar van de bilaterale is gericht met een fluorescerende marker, zoals ASH (<strong class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij wil Manuel Zimmer bedanken voor het verstrekken van ons met het oorspronkelijke ontwerp-bestand dat werd aangepast voor gebruik met males; Frank Schroeder voor de synthese en de levering van ascr #3; Ross Lagoy voor het inzicht en de hulp bij beeldvorming en analyse; en Laura Aurilio voor de master fabricage en die, naast Christopher Chute, bijgedragen tot de herziening van dit manuscript. Financiering voor dit werk werd verstrekt onder de National Institutes of Health subsidie 1R01DC016058-01 (J.S.), de National Science Foundation subsidie CBET 1605679 (D.R.A.) en de Burroughs-Wellcome Career Award op de wetenschappelijke Interface (D.R.A.).
Materials
| Silicon Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | – | Custom order. Printed at 25,000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hard Tubing | IDEX Health & Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 30 mL syringes | Vitality Medical | 302832 | Used as buffer reservoirs. |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Control System LF-5 Plasma System | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vacuum Desicator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm inner diameter. |
| Weigh Boats | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glass Pasteur Pipettes | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transfer pipettes | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Model Number: 1500E. |
| 60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss | – | |
| Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blue Fluorescent Light | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Illumination Adaptor | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve | Parker | 001-0017-900 | 3-way valve for controlling flow. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro Manager | Micro-Manager | – | Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release |
| ImageJ | ImageJ | – | Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Agar, Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Store at 4 °C. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Light Sensitive. Store in photoprotective vials. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | – | – | Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University). |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | – | – | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library. |
| CEM GCaMP6 line | – | – | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | – | – | To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle. |
References
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
- Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).
- Chronis, N. Worm chips: Microtools for C. elegans biology. Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).
- Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm. Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).
- Lockery, S. R., et al. A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans. Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nat Commun. 7, 13023 (2016).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Front Mol Neuro. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1 (2), 025008 (2014).
- Tatro, E. T. Brain-wide imaging of neurons in action. Front Neural Circuits. 8, 31 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior. Elife. 5, (2016).
- Kim, K., et al. Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans. Science. 326 (5955), 994-998 (2009).
- McGrath, P. T., et al. Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes. Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).
- Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (8), e43164 (2012).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1 (1986).
- White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).
- Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
- Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
- Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. Ascaroside signaling in C. elegans. WormBook. , 1-22 (2013).
- Narayan, A., et al. Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).
- Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
- Sammut, M., et al. Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans. Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).
- Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures. Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).
- Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
- Cáceres, I. d. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies. PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- García, L. R., Portman, D. S. Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans. Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).
- Clokey, G. V., Jacobson, L. A. The autofluorescent "lipofuscin granules" in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes. Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).
- Coburn, C., et al. Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans. PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).
- Macosko, E. Z., et al. A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans. Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).
- Park, D., et al. Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).
