באמצעות שבב חוש הריח של Microfluidic מותאם עבור ההדמיה של פעילות. עצבית בתגובה פרומונים בנוירונים הראש הגברי C. Elegans
Summary
השימוש מותאם “צ’יפ חוש הריח” עבור ההדמיה סידן יעיל של C. elegans זכרים מתואר כאן. מחקרים של חשיפה זכר גליצרול פרומון מוצגים גם.
Abstract
השימוש של סידן אינדיקטורים התעלתה ההבנה שלנו של דינמיקה עצבית ורגולציה. תולעים נימיות Caenorhabditis elegans, עם מערכת העצבים לחלוטין ממופה, אנטומיה שקוף, מציג מודל אידיאלי להבנת הדינמיקה עצבית בזמן אמת באמצעות מחווני סידן. בשילוב עם טכנולוגיות microfluidic עיצובים ניסיוניים, מחקרים סידן-הדמיה באמצעות אינדיקטורים אלה מבוצעות בבעלי חיים חינם-המעבר והן לכוד. עם זאת, רוב המחקרים הקודמים ניצול התקני לכידה, כגון השבב חוש הריח המתוארים Chronis. et al., יש התקנים שנועדו לשימוש ההרמפרודיט נפוץ יותר, כמו הזכר פחות נפוץ הוא שניהם מורפולוגית, מבחינה מבנית שונה. שבב חוש הריח מותאם היה מתוכנן, מפוברק ליעילות מוגברת בתחום ההדמיה עצביים זכר עם באמצעות בעלי חיים למבוגרים צעירים. פנייה סופחה התולעת בטעינת לנמל כדי לסובב את החיות, כדי לאפשר את ההפרדה של הנוירונים בודדים בתוך זוג הדו-צדדיים בתחום ההדמיה 2D. תולעים נחשפים זרימה מבוקרת של odorant בתוך המכשיר microfluidic, כמתואר במחקרים קודמים דו-מיניים. תופעות מעבר סידן ואז ניתוח שימוש בתוכנת קוד פתוח ImageJ. ההליך המתואר במסמך זה אמור לאפשר עבור כמות מוגברת של מבוססי זכר C. elegans סידן הדמיה מחקרים, העמקת ההבנה שלנו על מנגנוני איתות עצביים מין ספציפי.
Introduction
Microfluidic התקני מספקים גישה מוגברת דווקא בסביבות מבוקרות, שבו חיות, כגון תולעים נימיות C. elegans, יכול להיות מרומה השפעול1. מחקרים אלה כוללים מבחני התנהגות, מחקרי הדמיה סידן או הקרנות אפילו על הפנוטיפים ספציפיים, וכתוצאה מכך מדידות מדויקות יותר של תוצאות ניסוי1,2,3,4, 5,6. מיקרופלואידיקה לספק תנאים נוזלי בקנה מידה קטן שדרכו ניסויים מפורטים ניתן להפעיל תוך ניצול כמויות מינימליות של נוגדנים. יש הפקה מתמדת של עיצובים חדשים של המכשיר microfluidic, השימוש של כל משתנה, החל ארנאס המאפשרים טבעי sinusoidal התנועה של C. elegans מבחני התנהגות ולימודים הדמיה עצבית, מלכודת התקנים המשמשים הדמיה עצבית ולימודים חוש הריח, התקנים המאפשרים עבור תפוקה גבוהה פנוטיפי ניתוח גנטי מסכי4,5,6,7. בעקבות ייצור של תבנית בסיס, microfluidic מכשירים זולים לבנות — נתן את שימושית של המאסטר — וקל לשימוש, ומאפשר לדור נתונים מהירה באמצעות מחקרים תפוקה גבוהה. הזיוף של התקנים באמצעות פולימרים כגון polydimethylsiloxane (PDMS) מאפשר היצירה של מכשירים חדשים בתוך שעות.
מחקרי הדמיה סידן להשתמש סידן מקודדים גנטית אינדיקטורים (GECIs) המתבטא התאים היעד כדי למדוד את הדינמיקה עצבית של תאים אלה בזמן אמת8,9,10,11. הטבע שקוף של C. elegans מאפשר ההקלטה של פלורסנט רמות החלבונים האלה בבעלי חיים. באופן מסורתי, GECIs להסתמך על חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-מבוסס חיישן ה-GFP-קלמודולין-M13 פפטיד (GCaMP), אך מחקרים מאוחרים יותר הסתגלו חיישנים אלה כדי לאפשר יותר יחס אות לרעש ופרופילים עירור אדום-העביר. בעקבות הפיתוח של GCaMP3, חלבונים עם מפרטים אלה יש מגוונים, כולל חיישנים כגון GCaMP6s ו- GCaMP6f (לאט ומהר פלורסצנטיות חופש-המחירים, בהתאמה), כמו גם RFP-קלמודולין-M13 פפטיד (RCaMP), אשר יש אדום-העביר הפעלת פרופיל. השילוב של אלה GECIs עם C. elegans גנים ספציפיים תא יזם רצפי ניתן לייעד תאים עניין, במיוחד החישה הניריונים12,13,14,15 , 16.
בעוד קלות השימוש C. elegans במחקרים microfluidic הוא לכאורה, כמעט כל המחקרים התמקדו אנדרוגינוסים. למרות זכרים בלבד החשבונאי 0.01-0.02% מהאוכלוסייה פראי סוג, ממצאים שלא יסולא בפז יכול לנבוע האפיון שלהם. ואילו connectome הפיזי של מערכת העצבים אנדרוגינוס מופה באופן מלא במשך עשרות שנים17, connectome זכר נשאר שלם, במיוחד באזור הראש של בעלי חיים18. השימוש של סידן הדמיה של הזכרים יסייע ליצירת הבנה של מערכת העצבים זכר וההבדלים שעולות בין שני המינים. גודל קטן יותר מהזכרים הבוגרים C. elegans מונעת השמנה יעיל ואמין בנמלי טעינת התקנים חוש הריח מסורתי המיועד אנדרוגינוסים גדול יותר. כדי לטפל בבעיה זו, יש את הגירסה שבב חוש הריח Chronis19 פותחה עם יציאת הטעינה צר יותר, ערוץ בגובה נמוך, והופך בנמל הטעינה תולעת (אשר לסובב את החיה), המאפשר החזיית הדו-צדדיים שמאלה/ימינה זוגות עצביים. עיצוב זה מאפשר: (1) השמנה יעיל של זכרים בוגרים צעירים, (2) כיוון יותר אמין של החיה עבור הפריט החזותי של שני בני נוירונים לזווג דו צדדיים, (3) הדמיה מדויקת של פעילות עצבית בנוירונים זכר.
יותר ויותר מחקרים מראים כי גברים C. elegans להגיב באופן שונה מאשר אנדרוגינוסים למגוון רחב של ascarosides (ascr), או תולעים נימיות פרומונים20,21,22,23 ,24. לכן, לפתח הבנה של דינמיקה עצבית, ייצוגים בתוך connectome זכר הפך אפילו יותר רלוונטי. זכר C. elegans מכיל נוירונים ספציפיים סקס 87 לא נוכח אנדרוגינוס25,26, לשנות את connectome כדרכים שטרם נקבע. היכולת תמונה הדינמיקות האלה עצביות ייחודיות יאפשר לנו להבין טוב יותר את תגובות ספציפיות סקס וייצוגי עצבית.
פרוטוקול זה מתאר את השימוש שבב חוש הריח זכר הותאם עבור ההדמיה עצבית של זכר C. elegans chemosensation. הנוירון nociceptive שאש מגיב בצורה אמינה גליצרול 1 מ’ אצל הזכרים, בקנה אחד עם הקודם אנדרוגיניות מחקרים27. חשיפה ascarosides עשוי להפיק תגובות כי הם משתנה חיה כדי חיה, הדורשות מספר גדול יותר של בעלי חיים כדי להיבדק. התגובה של הנוירונים צ’ם זכר הספציפי שהוצג בעבר, דרך אלקטרופיזיולוגיה וגם סידן הדמיה מחקרים, להגיב variably ascaroside #323.
Protocol
Representative Results
Discussion
השבב חוש הריח הותאם זכר משלבת פנייה לתוך נמל טעינה צר יותר, אשר מאפשר שליטה רבה יותר כיוון ועבור לכידה יעילה של זכר C. elegans. דבר זה מאפשר הפריט החזותי של שני ימינה ושמאלה חברי זוגות דו צדדיים עצביים, ללא צורך z-לערום. עקום זה מוביל אוריינטציה מרחק אנכי 100% של הזמן תולעים שבו זוג הדו-צדדיים ר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות מנואל הצימר סיפק לנו הקובץ הראשוני בעיצוב הותאם לשימוש עם זכרים; פרנק שרדר על סינתזה ועל אספקת ascr #3; רוס Lagoy כדי להפוך את התובנה בסיוע הדמיה וניתוח; לורה Aurilio על הזיוף הבסיס, ומי, לצד כריסטופר המצנח, תרמו הסקירה של כתב היד הזה. מימון עבור עבודה זו סופקה תחת של מכוני הבריאות הלאומיים גרנט 1R01DC016058-01 (ס), המענק הלאומית למדע CBET 1605679 (D.R.A.), ופרס בורוז Wellcome הקריירה ב מדעי ממשק (D.R.A.).
Materials
| Silicon Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | – | Custom order. Printed at 25,000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hard Tubing | IDEX Health & Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 30 mL syringes | Vitality Medical | 302832 | Used as buffer reservoirs. |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Control System LF-5 Plasma System | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vacuum Desicator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm inner diameter. |
| Weigh Boats | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glass Pasteur Pipettes | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transfer pipettes | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Model Number: 1500E. |
| 60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss | – | |
| Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blue Fluorescent Light | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Illumination Adaptor | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve | Parker | 001-0017-900 | 3-way valve for controlling flow. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro Manager | Micro-Manager | – | Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release |
| ImageJ | ImageJ | – | Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Agar, Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Store at 4 °C. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Light Sensitive. Store in photoprotective vials. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | – | – | Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University). |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | – | – | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library. |
| CEM GCaMP6 line | – | – | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | – | – | To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle. |
References
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
- Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).
- Chronis, N. Worm chips: Microtools for C. elegans biology. Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).
- Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm. Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).
- Lockery, S. R., et al. A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans. Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nat Commun. 7, 13023 (2016).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Front Mol Neuro. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1 (2), 025008 (2014).
- Tatro, E. T. Brain-wide imaging of neurons in action. Front Neural Circuits. 8, 31 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior. Elife. 5, (2016).
- Kim, K., et al. Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans. Science. 326 (5955), 994-998 (2009).
- McGrath, P. T., et al. Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes. Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).
- Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (8), e43164 (2012).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1 (1986).
- White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).
- Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
- Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
- Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. Ascaroside signaling in C. elegans. WormBook. , 1-22 (2013).
- Narayan, A., et al. Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).
- Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
- Sammut, M., et al. Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans. Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).
- Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures. Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).
- Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
- Cáceres, I. d. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies. PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- García, L. R., Portman, D. S. Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans. Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).
- Clokey, G. V., Jacobson, L. A. The autofluorescent "lipofuscin granules" in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes. Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).
- Coburn, C., et al. Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans. PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).
- Macosko, E. Z., et al. A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans. Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).
- Park, D., et al. Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).
