पुरुष C. एलिगेंस सिर ंयूरॉंस में Pheromones के जवाब में ंयूरॉन गतिविधि के इमेजिंग के लिए एक अनुकूलित Microfluidic घ्राण चिप का प्रयोग
Summary
एक अनुकूलित “घ्राण चिप” के कुशल कैल्शियम इमेजिंग के लिए का उपयोग करें C. एलिगेंस नर यहां वर्णित है । ग्लिसरॉल और एक फेरोमोन के पुरुष एक्सपोजर का अध्ययन भी दिखाया गया है ।
Abstract
कैल्शियम संकेतकों का उपयोग बहुत तंत्रिका गतिशीलता और विनियमन की हमारी समझ को बढ़ाया है । निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस, अपनी पूरी तरह से मैप तंत्रिका तंत्र और पारदर्शी शरीर रचना के साथ, कैल्शियम संकेतक का उपयोग कर वास्तविक समय तंत्रिका गतिशीलता को समझने के लिए एक आदर्श मॉडल प्रस्तुत करता है । microfluidic प्रौद्योगिकियों और प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ संयोजन में, इन संकेतकों का उपयोग कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन दोनों मुक्त चलती है और फंस जानवरों में प्रदर्शन कर रहे हैं । हालांकि, सबसे पिछले अध्ययनों से इस तरह के घ्राण चिप के रूप में फँसाने उपकरणों का उपयोग, Chronis एट अलमें वर्णित., अधिक आम द्विलिंग में उपयोग के लिए डिजाइन उपकरणों है, के रूप में कम आम पुरुष दोनों आकृति और संरचनात्मक है भिंन. एक अनुकूलित घ्राण चिप डिजाइन और युवा वयस्क जानवरों का उपयोग कर के साथ पुरुष ंयूरॉन इमेजिंग में वृद्धि की क्षमता के लिए गढ़े गया था । एक बारी कीड़ा लदान बंदरगाह में शामिल करने के लिए जानवरों को घुमाएगी और 2d इमेजिंग में एक द्विपक्षीय जोड़ी के भीतर व्यक्तिगत ंयूरॉंस की जुदाई के लिए अनुमति दी गई । कीड़े microfluidic डिवाइस के भीतर एक नियंत्रित प्रवाह के लिए संपर्क कर रहे हैं, के रूप में पिछले द्विलिंग अध्ययन में वर्णित है । कैल्शियम यात्रियों तो खुले स्रोत सॉफ्टवेयर ImageJ का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं । इस के साथ साथ वर्णित प्रक्रिया पुरुष की एक बढ़ी हुई राशि के लिए अनुमति चाहिए-आधारित C. एलिगेंस कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन, सेक्स के तंत्र की हमारी समझ को मजबूत बनाने-विशिष्ट ंयूरॉंस संकेतन ।
Introduction
Microfluidic उपकरणों के लिए ठीक नियंत्रित वातावरण, जिसमें पशुओं, जैसे निमेटोड C. एलिगेंस, प्रयोग किया जा सकता है1हेरफेर करने के लिए वृद्धि की पहुंच प्रदान करते हैं । ये अध्ययन व्यवहार परख, कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन, या भी विशिष्ट phenotypes के लिए प्रदर्शन, प्रयोगात्मक परिणाम1के अधिक सटीक माप में जिसके परिणामस्वरूप शामिल है,2,3,4, 5,6. Microfluidics छोटे पैमाने पर तरल शर्तों के माध्यम से जो विस्तृत प्रयोगों चला जा सकता है प्रदान करते हुए रिएजेंट की ंयूनतम मात्रा का उपयोग । वहां नए microfluidic डिवाइस डिजाइन के एक निरंतर उत्पादन है, और प्रत्येक के उपयोग के क्षेत्र से भिंन होता है, जो व्यवहार परख और तंत्रिका इमेजिंग अध्ययन में सी. एलिगेंस के प्राकृतिक sinusoidal गति के लिए अनुमति देते हैं, जाल में प्रयुक्त उपकरणों के लिए तंत्रिका इमेजिंग और घ्राण अध्ययन, आनुवंशिक स्क्रीन4,5,6,7में उच्च प्रवाह phenotypic विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं कि उपकरणों के लिए । एक मास्टर मोल्ड के निर्माण के बाद, microfluidic उपकरणों का निर्माण करने के लिए सस्ती कर रहे है-मास्टर के प्रयोज्य दिया-और प्रयोग करने में आसान, उच्च प्रवाह अध्ययन के माध्यम से तेजी से डेटा पीढ़ी के लिए अनुमति दी । ऐसे polydimethylsiloxane (PDMS) के रूप में पॉलिमर का उपयोग उपकरणों का निर्माण घंटे के भीतर नए उपकरणों के निर्माण के लिए अनुमति देता है ।
कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECIs) वास्तविक समय8,9,10,11में उन कोशिकाओं के तंत्रिका गतिशीलता को मापने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं में व्यक्त का उपयोग करें । सी. एलिगेंस की पारदर्शी प्रकृति रहते जानवरों में इन प्रोटीन के फ्लोरोसेंट स्तर की रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है । परंपरागत रूप से, GECIs ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन पर भरोसा (GFP) आधारित सेंसर GFP-Calmodulin-M13 पेप्टाइड (GCaMP), हालांकि अधिक हाल के अध्ययनों से इन सेंसरों अनुकूलित किया है के लिए बेहतर संकेत करने के लिए शोर अनुपात और लाल-स्थानांतरित उत्तेजना प्रोफाइल के लिए अनुमति देते हैं. GCaMP3 के विकास के बाद, इन विनिर्देशों के साथ प्रोटीन GCaMP6s और GCaMP6f के रूप में सेंसर सहित विविध है, (धीमी और तेजी से प्रतिदीप्ति बंद दरों, क्रमशः), साथ ही साथ आरएफपी-Calmodulin-M13 पेप्टाइड (RCaMP), जो एक लाल है स्थानांतरित सक्रियण प्रोफ़ाइल । C. एलिगेंस सेल के साथ इन GECIs का संयोजन विशिष्ट जीन प्रमोटर अनुक्रम ब्याज की कोशिकाओं को लक्षित कर सकते हैं, विशेष रूप से संवेदी ंयूरॉंस12,13,14,15 , 16.
जबकि microfluidic अध्ययन में सी. एलिगेंस उपयोग की सुगमता स्पष्ट है, लगभग सभी अध्ययनों ने hermaphrodites पर ध्यान केंद्रित किया है. पुरुषों के बावजूद केवल 0.01 के लिए लेखांकन-जंगली प्रकार की आबादी का 0.02%, अमूल्य निष्कर्ष उनके लक्षण वर्णन से पैदा कर सकते हैं । जबकि द्विलिंग तंत्रिका तंत्र के भौतिक connectome पूरी तरह से17दशकों के लिए मैप किया गया है, पुरुष connectome अधूरा रहता है, विशेष रूप से पशु18के प्रमुख क्षेत्र में । पुरुषों में कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करने के लिए पुरुष तंत्रिका तंत्र और मतभेद है कि दो लिंगों के बीच पैदा की समझ पैदा करने में मदद मिलेगी । C. एलिगेंस वयस्क पुरुषों के छोटे आकार बड़े hermaphrodites के लिए डिज़ाइन किया गया पारंपरिक घ्राण उपकरणों की लोडिंग बंदरगाहों में प्रभावी और विश्वसनीय फँसाने रोकता है । इस पते के लिए, Chronis घ्राण चिप के एक संशोधित संस्करण19 एक संकरा लोडिंग बंदरगाह, एक कम चैनल ऊंचाई के साथ विकसित किया गया था, और कीड़ा लोड हो रहा है बंदरगाह में बदल जाता है (जो जानवर घुमाते हैं), द्विपक्षीय के दृश्य के लिए अनुमति छोड़/ न्यूरॉन्स जोड़े. इस डिजाइन परमिट: (1) युवा वयस्क पुरुषों के प्रभावी फँसाना, (2) द्विपक्षीय युग्मित न्यूरॉन्स के दोनों सदस्यों के दृश्य के लिए पशु का एक अधिक विश्वसनीय अभिविन्यास, और (3) पुरुष न्यूरॉन्स में तंत्रिका गतिविधि की सटीक इमेजिंग.
तेजी से, अध्ययनों से पता चलता है कि C. एलिगेंस नर ascarosides (ascr), या निमेटोड pheromones20,21,22,23 की एक किस्म को hermaphrodites से अलग ढंग से प्रतिक्रिया ,24. इसलिए, पुरुष connectome के भीतर तंत्रिका गतिशीलता और अभ्यावेदन की समझ विकसित करना और भी प्रासंगिक हो गया है. पुरुष सी. एलिगेंस शामिल ८७ सेक्स विशिष्ट ंयूरॉंस में मौजूद नहीं द्विलिंग25,26, में फेरबदल connectome के रूप में अभी तक अनिर्धारित तरीके । छवि के लिए सक्षम होने के नाते इन अद्वितीय तंत्रिका गतिशीलता हमें बेहतर सेक्स को समझने के लिए विशिष्ट प्रतिक्रियाओं और तंत्रिका अभ्यावेदन की अनुमति देगा ।
इस प्रोटोकॉल पुरुष सी एलिगेंस chemosensation के तंत्रिका इमेजिंग के लिए एक पुरुष अनुकूलित घ्राण चिप के उपयोग का वर्णन करता है । nociceptive ंयूरॉन राख पुरुषों में 1 मीटर ग्लिसरॉल को मज़बूती से जवाब, पिछले उभयलिंगी अध्ययन के साथ संगत27। ascarosides के संपर्क में पशु से पशु के लिए चर रहे हैं कि प्रतिक्रियाओं का परीक्षण किया जा करने के लिए पशुओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है । पुरुष विशिष्ट CEM ंयूरॉंस की प्रतिक्रिया पहले, दोनों इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन के माध्यम से दिखाया गया है, को ascaroside #323के लिए निश्चित रूप से जवाब ।
Protocol
1. डिवाइस निर्माण
नोट: संदर्भ 1 .
ध्यान दें: सिलिकॉन मास्टर मोल्ड पैटर्न के लिए मानक photolithographic तकनीकों का उपयोग कर गढ़े गए एसयू-8 एक सिलिकॉन मास्टर पर photoresist < सुप वर्ग = "xr…
Representative Results
Discussion
पुरुष अनुकूलित घ्राण चिप एक संकरा लोडिंग बंदरगाह है, जो अभिविंयास के अधिक नियंत्रण के लिए और पुरुष सी. एलिगेंसके कुशल फँसाने के लिए अनुमति देता है में एक मोड़ शामिल हैं । यह दोनों के बाईं और सही सदस्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम हमें प्रारंभिक डिजाइन फ़ाइल है कि पुरुषों के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया था के साथ उपलब्ध कराने के लिए मैनुअल Zimmer शुक्रिया अदा करना चाहूंगा; संश्लेषण और ascr # 3 की आपूर्ति के लिए फ्रैंक श्रोएडर; अंतर्दृष्टि और इमेजिंग और विश्लेषण के साथ सहायता के लिए रॉस लागो; और गुरु निर्माण के लिए लौरा Aurilio और जो, क्रिस्टोफर ढलान के साथ, इस पांडुलिपि की समीक्षा करने के लिए योगदान दिया । इस काम के लिए फंडिंग नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट 1R01DC016058-01 (जे), नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रांट CBET १६०५६७९ (D.R.A.), और साइंटिफिक इंटरफेस (बरोज) में D.R.A. वेलकम करियर अवार्ड के तहत प्रदान की गई ।
Materials
| Silicon Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | – | Custom order. Printed at 25,000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hard Tubing | IDEX Health & Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 30 mL syringes | Vitality Medical | 302832 | Used as buffer reservoirs. |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Control System LF-5 Plasma System | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vacuum Desicator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm inner diameter. |
| Weigh Boats | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glass Pasteur Pipettes | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transfer pipettes | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Model Number: 1500E. |
| 60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss | – | |
| Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blue Fluorescent Light | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Illumination Adaptor | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve | Parker | 001-0017-900 | 3-way valve for controlling flow. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro Manager | Micro-Manager | – | Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release |
| ImageJ | ImageJ | – | Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Agar, Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Store at 4 °C. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Light Sensitive. Store in photoprotective vials. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | – | – | Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University). |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | – | – | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library. |
| CEM GCaMP6 line | – | – | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | – | – | To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle. |
References
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
- Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).
- Chronis, N. Worm chips: Microtools for C. elegans biology. Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).
- Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm. Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).
- Lockery, S. R., et al. A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans. Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nat Commun. 7, 13023 (2016).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Front Mol Neuro. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1 (2), 025008 (2014).
- Tatro, E. T. Brain-wide imaging of neurons in action. Front Neural Circuits. 8, 31 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior. Elife. 5, (2016).
- Kim, K., et al. Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans. Science. 326 (5955), 994-998 (2009).
- McGrath, P. T., et al. Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes. Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).
- Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (8), e43164 (2012).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1 (1986).
- White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).
- Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
- Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
- Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. Ascaroside signaling in C. elegans. WormBook. , 1-22 (2013).
- Narayan, A., et al. Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).
- Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
- Sammut, M., et al. Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans. Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).
- Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures. Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).
- Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
- Cáceres, I. d. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies. PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- García, L. R., Portman, D. S. Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans. Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).
- Clokey, G. V., Jacobson, L. A. The autofluorescent "lipofuscin granules" in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes. Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).
- Coburn, C., et al. Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans. PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).
- Macosko, E. Z., et al. A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans. Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).
- Park, D., et al. Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).
