Bruke en tilpasset Microfluidic Olfactory Chip for avbilding av Neuronal aktivitet svar feromoner i mannlige C. Elegans hodet nerveceller
Summary
Bruk av en tilpasset “olfactory chip” for effektiv kalsium avbilding av C. elegans menn er beskrevet her. Studier av mannlige eksponering til glyserol og en feromon vises også.
Abstract
Bruk av kalsium indikatorer har kraftig forbedret vår forståelse av nevrale dynamikk og regulering. Rundormer Caenorhabditis elegans, helt tilordnet nervesystemet og gjennomsiktig anatomi, presenterer en ideell modell for å forstå sanntid nevrale dynamics bruke kalsium indikatorer. I kombinasjon med microfluidic teknologi og eksperimentell design, er kalsium-imaging studier med disse indikatorene utført i både fritt bevegelige og fanget dyrene. Men har de fleste tidligere studier utnytte fangst enheter, for eksempel olfactory chip beskrevet i Chronis et al., enheter designet for bruk i den vanligste Hermafroditt, mindre vanlig hannen er begge morphologically og strukturelt ulike. En tilpasset olfactory chip ble designet og laget for økt effektivitet på mannlige neuronal bildebehandling med bruke ung voksen dyr. En sving ble innlemmet i ormen lasting port rotere dyrene og tillate for separasjon av individuelle neurons med et bilateralt par i 2D bildebehandling. Ormer er utsatt for en kontrollert flyt av odorant i microfluidic enheten, som beskrevet i tidligere Hermafroditt studier. Kalsium transienter analyseres deretter ved hjelp av åpen kildekode programvare ImageJ. Fremgangsmåten som er beskrevet her bør tillate økt mengde hann-baserte C. elegans kalsium imaging studier, utdype vår forståelse av mekanismer for sex-spesifikke neuronal signalering.
Introduction
Microfluidic enheter gir økt tilgang til nettopp kontrollerte miljøer, der dyr, som Rundormer C. elegans, kan være eksperimentelt manipulert1. Disse studiene inkluderer atferdsmessige analyser, kalsium tenkelig studier eller selv visninger for bestemte fenotyper, noe som resulterer i mer nøyaktige målinger av eksperimentelle resultater1,2,3,4, 5,6. MicroFluidics gir småskala flytende forhold som detaljert eksperimenter kan kjøres mens benytte minimale mengder reagenser. Det er en konstant produksjon av nye microfluidic enheten design, og bruk av hver varierer fra arenaer som tillater naturlig sinusformet bevegelse C. elegans i atferdsdata analyser og nevrale tenkelig studier, å fange enheter i nevrale bildebehandling og olfactory studier, til enheter som tillater for høy gjennomstrømming fenotypiske analyse i genetisk skjermer4,5,6,7. Etter fabrikasjon av en master mold, microfluidic enheter er billig å konstruere-gitt gjenbruk av master- og enkel å bruke, slik at for rask data generasjon via høy gjennomstrømming studier. Fabrikasjon av enheter ved hjelp av polymerer som polydimethylsiloxane (PDMS) tillater opprettelsen av nye enheter innen timer.
Kalsium tenkelig studier bruker genetisk kodet kalsium indikatorer (GECIs) i målcellene for å måle nevrale dynamikken i disse cellene i sanntid8,9,10,11. Gjennomsiktig natur C. elegans tillater innspillingen av fluorescerende nivåene av disse proteinene i levende dyr. Tradisjonelt GECIs stole på grønne fluorescerende protein (GFP)-basert sensoren GFP-Calmodulin-M13 peptid (GCaMP), selv om nyere studier har tilpasset disse sensorer for bedre signal-til-støy-forhold og rød-skiftet eksitasjon profiler. Etter utviklingen av GCaMP3, proteiner med disse spesifikasjonene har variert, inkludert sensorer som GCaMP6s og GCaMP6f (langsom og rask fluorescens av-priser, henholdsvis), samt RFP-Calmodulin-M13 peptid (RCaMP), som har en rød-skiftet aktivisering profil. Kombinasjonen av disse GECIs med C. elegans celle-spesifikke genet promoter sekvenser kan målrette celler av interesse, spesielt sensoriske neurons12,13,14,15 , 16.
Mens brukervennligheten C. elegans i microfluidic studier er tydelig, har nesten alle studier fokusert på hermafroditter. Til tross for menn bare regnskap for 0,01-0,02% av befolkningen vill type, uvurderlig funn kan oppstå fra deres karakteristikk. Mens den fysiske connectome i Hermafroditt nervesystemet er fullt tilordnet for tiår17, fortsatt den mannlige connectome ufullstendig, spesielt i regionen hodet i dyr18. Bruk av kalsium imaging hos menn vil hjelpe generere en forståelse av mannlige nervesystemet og forskjeller som oppstår mellom to kjønnene. Mindre størrelsen på C. elegans voksne hanner forhindrer effektiv og pålitelig overlapping i lasting portene på tradisjonelle olfactory enheter designet for større hermafroditter. For å løse dette, en modifisert versjon av Chronis Olfactory Chip19 ble utviklet med en smalere lasting port, en lavere kanal høyde, og viser i ormen lasting port (som roterer dyret), slik at effekten av bilaterale venstre/høyre neuronal parene. Dette tillater: (1) effektiv overlapping av unge voksne hanner, (2) en sikrere orientering av dyret for visualisering av både medlemmer av bilaterale sammenkoblede neurons, og (3) nøyaktig bildebehandling nevrale aktivitet i mannlige neurons.
Stadig, viser studier at C. elegans menn reagere annerledes enn hermafroditter til en rekke ascarosides (ascr) eller Rundormer feromoner20,21,22,23 ,24. Derfor blitt utvikle en forståelse av nevrale dynamikk og representasjoner i den mannlige connectome enda mer relevant. Mannlige C. elegans inneholder 87 sex-spesifikke neurons finnes ikke i Hermafroditt25,26, endre connectome i som-ennå ubestemt måter. Å kunne bilde disse unike nevrale dynamikken vil tillate oss å bedre forstå sex-spesifikke tiltak og nevrale representasjoner.
Denne protokollen beskriver bruken av en mann-tilpasset olfactory chip for neural avbilding av mannlige C. elegans chemosensation. Nociceptive Nevron aske svarer pålitelig 1 M glyserol inne hanndyr, konsekvent med forrige hermafroditter studier27. Eksponering for ascarosides kan framprovosere reaksjoner som er variabel fra dyr til dyr, krever et større antall dyr skal testes. Responsen av mann-spesifikke CEM neurons har tidligere vist, gjennom både electrophysiology og kalsium imaging studier, svare ulik ascaroside #323.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hann-tilpasset olfactory chip opptar en sving i en smalere lasting port, som gir mer kontroll over retningen og effektiv overlapping av mannlige C. elegans. Dette gir effekten av både venstre og høyre neuronal bilaterale par, uten behov for z-stabling. Denne kurven fører til en retning fra loddrett 100% av tiden i worms hvor bare ett bilaterale par er mål fluorescerende markøren, som ASH (figur 2D-E)29,30</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Manuel Zimmer for å gi oss filen opprinnelige utforming som ble tilpasset for bruk med menn; Frank Schroeder for syntese og forsyning av ascr #3; Ross Lagoy for innsikt og hjelp med bildebehandling og analyse; og Laura Aurilio for master fabrikasjon og som, sammen med Christopher Chute, bidro til gjennomgang av dette manuskriptet. Midler til dette arbeidet ble gitt under den National Institutes of Health grant 1R01DC016058-01 (js), National Science Foundation grant CBET 1605679 (D.R.A.) og Burroughs Wellcome karriere prisen på vitenskapelige Interface (D.R.A.).
Materials
| Silicon Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | – | Custom order. Printed at 25,000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hard Tubing | IDEX Health & Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 30 mL syringes | Vitality Medical | 302832 | Used as buffer reservoirs. |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Control System LF-5 Plasma System | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vacuum Desicator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm inner diameter. |
| Weigh Boats | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glass Pasteur Pipettes | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transfer pipettes | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Model Number: 1500E. |
| 60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss | – | |
| Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blue Fluorescent Light | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Illumination Adaptor | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve | Parker | 001-0017-900 | 3-way valve for controlling flow. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro Manager | Micro-Manager | – | Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release |
| ImageJ | ImageJ | – | Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Agar, Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Store at 4 °C. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Light Sensitive. Store in photoprotective vials. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | – | – | Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University). |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | – | – | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library. |
| CEM GCaMP6 line | – | – | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | – | – | To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle. |
References
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
- Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).
- Chronis, N. Worm chips: Microtools for C. elegans biology. Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).
- Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm. Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).
- Lockery, S. R., et al. A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans. Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nat Commun. 7, 13023 (2016).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Front Mol Neuro. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1 (2), 025008 (2014).
- Tatro, E. T. Brain-wide imaging of neurons in action. Front Neural Circuits. 8, 31 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior. Elife. 5, (2016).
- Kim, K., et al. Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans. Science. 326 (5955), 994-998 (2009).
- McGrath, P. T., et al. Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes. Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).
- Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (8), e43164 (2012).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1 (1986).
- White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).
- Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
- Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
- Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. Ascaroside signaling in C. elegans. WormBook. , 1-22 (2013).
- Narayan, A., et al. Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).
- Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
- Sammut, M., et al. Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans. Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).
- Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures. Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).
- Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
- Cáceres, I. d. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies. PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- García, L. R., Portman, D. S. Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans. Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).
- Clokey, G. V., Jacobson, L. A. The autofluorescent "lipofuscin granules" in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes. Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).
- Coburn, C., et al. Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans. PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).
- Macosko, E. Z., et al. A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans. Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).
- Park, D., et al. Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).
