Använda en anpassad mikroflödessystem Olfactory Chip för bildtagning av Neuronal aktivitet som svar på feromoner i manlig C. Elegans huvud nervceller
Summary
Användning av en anpassad ”lukt chip” för effektiv kalcium bildtagning av C. elegans män beskrivs här. Studier av manliga exponering till glycerol och ett feromon visas också.
Abstract
Användningen av kalcium indikatorer har kraftigt ökat vår förståelse av neurala dynamics och förordning. Nematoden Caenorhabditis elegans, med dess helt mappade nervsystemet och transparent anatomi, presenterar en idealmodell för att förstå realtid neurala dynamics använder kalcium indikatorer. I kombination med mikroflödessystem teknik och experimentell design utförs kalcium-imaging studier med dessa indikatorer i både fri-flytta och fångade djur. De flesta tidigare studier utnyttjar svällning enheter, till exempel lukt chip beskrivs i Chronis et al., har dock utrustning avsedd för användning i det vanligare hermafroditt, liksom den mindre vanliga manlign både morfologiskt och strukturellt olika. En anpassad olfactory chip ritades och fabricerade för ökad effektivitet i manliga neuronala imaging med unga vuxna djur. En sväng införlivades masken laddar port att rotera djuren och tillåta för separation av enskilda nervceller inom ett bilateralt par i 2D imaging. Maskar är utsatta för ett kontrollerat flöde av luktämnet inom mikroflödessystem enheten, som beskrivs i föregående hermafrodit studier. Kalcium transienter analyseras sedan med hjälp av öppen programvara ImageJ. Det förfarande som beskrivs häri bör möjliggöra en ökad mängd hane-baserade C. elegans kalcium imaging studier, fördjupa vår förståelse av kön-specifika nervcellernas signalering mekanismer.
Introduction
Mikroflödessystem enheter ger ökad tillgång till exakt kontrollerade miljöer, vari djur, såsom Nematoden C. elegans, kan försöksvis manipulerade1. Dessa studier omfattar beteende analyser, kalcium imaging studier eller ens filmvisningar för specifika fenotyper, vilket resulterar i mer exakta mätningar av experimentella resultat1,2,3,4, 5,6. Mikrofluidik ge småskaliga flytande villkor genom vilka detaljerade experiment kan köras samtidigt utnyttjar minimala mängder av reagenser. Det finns en konstant produktion av nya mikroflödessystem enhet mönster, och användning av varje varierar, från arenor som möjliggör naturliga sinusformad rörelse av C. elegans i behavioral analyser och neurala imaging studier, att fälla enheter används i neurala imaging och lukt studier, till enheter som möjliggör hög genomströmning fenotypiska analys i genetiska skärmar4,5,6,7. Efter tillverkning av en herre mögel, ultrakalla enheter är billiga att bygga — ges reusabilityen av befälhavaren — och lätt att använda, vilket möjliggör snabb data generation via hög genomströmning studier. Tillverkning av enheter med polymerer, såsom Polydimetylsiloxan (PDMS) möjliggör skapandet av nya enheter inom timmar.
Kalcium imaging studier använder genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs) uttryckta i målceller för att mäta neural dynamiken i dessa celler i realtid8,9,10,11. Transparent beskaffenhet C. elegans tillåter inspelning av fluorescerande nivåerna av dessa proteiner i levande djur. Traditionellt GECIs är beroende av grönt fluorescerande protein (GFP)-baserat sensor GFP-Calmodulin-M13 peptid (GCaMP), men nyare studier har anpassat dessa sensorer som möjliggör bättre signal-brus-förhållanden och röd-skiftat excitation profiler. Efter utvecklingen av GCaMP3, proteiner med dessa specifikationer har varierat, inklusive sensorer såsom GCaMP6s och GCaMP6f (långsamma och snabba fluorescens off-priser, respektive), samt RFP-Calmodulin-M13 peptid (troppy), som har en röd-skiftat aktivering profil. Kombinationen av dessa GECIs med C. elegans -specifika promotorn gensekvenser kan rikta celler av intresse, särskilt sensoriska nervceller12,13,14,15 , 16.
Medan C. elegans användarvänlighet i ultrakalla studier framgår, har nästan alla studier fokuserat på hermafroditer. Trots hanar endast står för 0,01-0,02% av vildtyp befolkningen, ovärderlig fynd kan uppstå från deras karakterisering. Medan den fysiska connectome hermafrodit nervsystemet har mappats fullt för årtionden17, förblir den manliga connectome ofullständig, särskilt i regionen huvud av djur18. Användning av kalcium imaging i män hjälper till att skapa förståelse för manliga nervsystemet och de skillnader som uppstår mellan de två könen. Den mindre storleken C. elegans vuxna män förhindrar effektivt och tillförlitligt svällning i lastningen hamnar i traditionella olfactory anordningar som är avsedda för större hermafroditer. För att åtgärda detta, en modifierad version av Chronis Olfactory Chip19 utvecklades med en smalare lastning hamn, en lägre kanal höjd, och vänder i masken lastningshamnen (som rotera djuret), vilket möjliggör visualisering av bilaterala vänster/höger neuronala par. Denna design tillåter: (1) effektiv fångst av unga vuxna män, (2) en mer pålitlig orientering av djuret för visualisering av båda medlemmar av bilaterala ihopkopplade neuroner, och (3) exakt avbildning av neural aktivitet i manliga nervceller.
Allt fler visar studier att C. elegans hanar svara annorlunda än hermafroditer på en mängd ascarosides (ascr) eller nematod feromoner20,21,22,23 ,24. Därför blivit utveckla en förståelse för de neurala dynamics och representationer inom den manliga connectome ännu mer relevant. Manliga C. elegans innehåller 87 kön-specifika nervceller inte närvarande i den hermafrodita25,26, förändra connectome i som-ännu obestämt sätt. Att kunna bild dessa unika neurala dynamics ger oss möjlighet att bättre förstå kön-specifika svaren och neurala representationer.
Det här protokollet beskriver användningen av en hane-anpassad olfactory chip för den neurala avbildning av manliga C. elegans chemosensation. Nociceptiva neuron Ask svarar tillförlitligt på 1 M glycerol i män, överensstämmer med tidigare hermafroditiska studier27. Exponering för ascarosides kan framkalla svar som är variabel från djur till djur, kräver ett större antal djur som skall undersökas. Svaret från hane-specifika CEM nervceller har tidigare visats, genom både elektrofysiologi och kalcium imaging studier, steglöst bemöta ascaroside #323.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hane-anpassad olfactory chip införlivar en sväng i en smalare lastning hamn, vilket möjliggör större kontroll av orienteringen och för effektiva fångstmetoder för manliga C. elegans. Detta möjliggör visualisering av både vänster och höger medlemmarna i neuronala bilaterala par, utan behov av z-stapling. Denna kurva leder till en orientering från vertikal 100% av tiden i maskar där endast ett bilateralt par är inriktad med en fluorescerande markör, såsom aska (figur 2D</stro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Manuel Zimmer för att förse oss med den ursprungliga design fil som var anpassad för användning med män; Frank Schroeder för syntes och leverans av ascr #3. Ross Lagoy för insikt och hjälp med bildhantering och analys. och Laura Aurilio för master tillverkning och som, tillsammans med Christopher Chute, bidragit till översynen av detta manuskript. Finansiering för detta arbete lämnades under den National Institutes of Health grant 1R01DC016058-01 (JS), National Science Foundation bidraget CBET 1605679 (D.R.A.) och utmärkelsen Burroughs Wellcome karriär på den vetenskapliga gränssnitt (D.R.A.).
Materials
| Silicon Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | – | Custom order. Printed at 25,000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hard Tubing | IDEX Health & Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 30 mL syringes | Vitality Medical | 302832 | Used as buffer reservoirs. |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Control System LF-5 Plasma System | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vacuum Desicator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm inner diameter. |
| Weigh Boats | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glass Pasteur Pipettes | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transfer pipettes | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Model Number: 1500E. |
| 60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss | – | |
| Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blue Fluorescent Light | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Illumination Adaptor | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve | Parker | 001-0017-900 | 3-way valve for controlling flow. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro Manager | Micro-Manager | – | Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release |
| ImageJ | ImageJ | – | Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Agar, Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Store at 4 °C. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Light Sensitive. Store in photoprotective vials. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | – | – | Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University). |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | – | – | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library. |
| CEM GCaMP6 line | – | – | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | – | – | To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle. |
References
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
- Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).
- Chronis, N. Worm chips: Microtools for C. elegans biology. Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).
- Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm. Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).
- Lockery, S. R., et al. A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans. Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nat Commun. 7, 13023 (2016).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Front Mol Neuro. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1 (2), 025008 (2014).
- Tatro, E. T. Brain-wide imaging of neurons in action. Front Neural Circuits. 8, 31 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior. Elife. 5, (2016).
- Kim, K., et al. Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans. Science. 326 (5955), 994-998 (2009).
- McGrath, P. T., et al. Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes. Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).
- Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (8), e43164 (2012).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1 (1986).
- White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).
- Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
- Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
- Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. Ascaroside signaling in C. elegans. WormBook. , 1-22 (2013).
- Narayan, A., et al. Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).
- Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
- Sammut, M., et al. Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans. Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).
- Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures. Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).
- Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
- Cáceres, I. d. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies. PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- García, L. R., Portman, D. S. Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans. Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).
- Clokey, G. V., Jacobson, L. A. The autofluorescent "lipofuscin granules" in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes. Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).
- Coburn, C., et al. Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans. PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).
- Macosko, E. Z., et al. A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans. Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).
- Park, D., et al. Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).
