Med hjälp av In Vivo och vävnad och Cell Explant metoder att studera morfogenes och patogenes av embryonala och Perinatal Aorta
Summary
Protokoll för att studera embryonala och perinatal murina aorta med i vivo klonal analys och öde kartläggning, aorta bladsticklingar och isolerade glatt muskulatur celler är detaljerade här. Dessa olika synsätt underlätta utredningen av morfogenes av embryonala och perinatal aorta i normal utveckling och patogenesen vid sjukdom.
Abstract
Aorta är den största artären i kroppen. Aortaväggen består av ett inre lager av endotelceller, ett mellanlager av omväxlande elastisk lamellerna och glatta muskelceller (SMCs) och ett yttre lager av fibroblaster och extracellulära matrix. I kontrast till den omfattande studien av patologiska modeller (t.ex. åderförkalkning) i vuxen aorta, är mycket mindre känt om embryonala och perinatal aorta. Här fokuserar vi på SMCs och tillhandahålla protokoll för analysen av morfogenes och patogenes för embryonala och perinatal aorta SMCs i normala utveckling och sjukdom. Specifikt, de fyra protokoll som ingår är: jag) i vivo embryonala öde kartering och klonal analys; (II) explant embryonala aorta kultur; (III) SMC isolering från perinatal aorta; och iv) subkutan osmotisk mini pumpen placering hos gravida (eller icke-gravida) möss. Således underlätta dessa synsätt utredningen av den ursprung, öde och klonal arkitektur för SMCs i aorta i vivo. De tillåter för modulerande embryonala aorta morfogenes i livmodern genom kontinuerlig exponering för farmakologiska medel. Dessutom, isolerad aorta vävnad explants eller aorta SMCs kan användas för att få insikter i rollen som specifik gen mål under grundläggande processer såsom muscularization, spridning och migration. Dessa hypotesgenererande experiment på isolerade SMCs och explanterad aorta kan sedan utvärderas i kontexten i vivo genom farmakologiska och genetiska metoder.
Introduction
Cirkulationssystem av flercelliga organismer funktion att leverera näringsämnen och syre till celler som är inte i kontakt med den yttre miljön och att avlägsna slaggprodukter och koldioxid från dessa celler. Hos ryggradsdjur består primära cirkulationssystemet av hjärtat, som pumpar blod genom en serie av blodkärl. Väggarna i stora blodkärl, såsom artärer och vener, består av tre lager: jag) den intima, eller inre lager av endotelceller; II) media eller mellersta lagret av alternerande maskrad långsträckt glatta muskelceller SMCs och elastisk lameller; och iii) den adventitia, eller yttre lager av bindväv och fibroblaster. De allra flesta studier i vaskulär biologi fokus på endotelceller, utreda bildandet av nya endothelial cellen-fodrade rör genom angiogenes. I jämförelse får SMCs relativt lite uppmärksamhet. SMCs är dock en kritisk celltyp i byggandet av normala kärlväggen och i vaskulära sjukdomar.
Aorta är den största-kaliber artären i kroppen, får hjärtminutvolymen från vänster kammare i hjärtat. Det drabbas av olika sjukdomar, däribland åderförkalkning, aneurysm och dissektion. I vuxna organismer studeras aorta och dess större grenar intensivt i modeller av vaskulär sjukdom. Exempelvis hög fett diet utfodras möss som är null för den gen som kodar den LDL-receptorn eller apolipoprotein E, utveckla ateroskleros och senaste öde mappning studier tyder på att befintliga SMCs ger upphov till flera celltyper i den aterosklerotiska plack1. I aortaaneurysm inkluderar patologiska förändringar SMC apoptos och extracellulär matrix remodeling2,3.
Betydligt mindre är känt om SMC morfogenes och patogenes under embryonala och perinatal perioder. Här tillhandahåller vi protokoll för att studera embryonala och perinatal aorta SMCs i vivo, i vävnad bladsticklingar och isolerade celler. Till exempel, skisserar den första delen av protokollet öde kartering och klonal analys i embryonala möss. CRE recombinase uttryckt under kontroll av en cell-specifika promotorn underlättar märkning av specifika celler och deras avkomma4,5,6. men kan temporal kontroll av cell-specifik märkning vara utmanande under embryonalutvecklingen hos möss. I detta sammanhang tillhandahåller med embryon som uttrycker den villkorliga CreER under en promotor som är aktiva i SMCs (e.g.,Myh11 eller Acta2) och Cre reporter, vi metoder för att injicera tamoxifen eller dess aktiva metabolit 4-OH-tamoxifen i gravid dammar och för att analysera märkt cellerna på embryon eller postnatal avkomma. Dessutom, i motsats till öde mappning studier, som huvudsakligen använder Cre reportrar med en enda reporter fluorophore1,7, klonal analys är väsentligen ökat med flerfärgade Cre reportrar.
I andra och tredje avsnitt av protokollet beskrivs metoder för att isolera och odla embryonala aorta bladsticklingar och aorta SMCs från nyfödda, respektive. Dessa synsätt möjliggöra manipulation av signalvägar, särskilt i aorta bladsticklingar eller SMCs, och för att analysera de direkta effekterna av farmakologiska medel. Rollen av specifika gener i vävnaden av intresse kan således undersökas på ett mycket snabbare sätt än genom traditionella genetiska manipulationer hos möss. Dessutom isolerade SMC studierna underlätta analysen av cellmigration och vidhäftning, som är tekniskt begränsad i vivo.
Slutligen, den fjärde protokollenheten skisserar placeringen av en subkutan osmotisk mini pump laddad med farmakologiska agenter i gravid (eller icke-gravida) möss. Denna metod underlättar analysen av effekten på embryonal utveckling orsakas av agenter som kräver kontinuerlig infusion på grund av snabb metabolism. Alternativet att täta injektioner är inte praktiskt för många agenter och bör undvikas, eftersom det kan orsaka betydande obehag i gravid dammen.
Protocol
Representative Results
Discussion
I kontrast till de omfattande utredningarna av murina aorta och dess större grenar i vuxen sjukdomstillstånd, såsom modeller för åderförkalkning, är mindre känt om morfogenes och patogenesen av embryonala och perinatal aorta. Här, vi fokuserar på embryonal/perinatal aorta, särskilt SMCs, och tillhandahåller protokoll för att studera aorta genom in-vivo, vävnad explant, och SMC isolering strategier. Dessa gratis synsätt ger utredaren med olika metoder att studera embryonala/perinatal aorta.
<p …Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dean Li för att dela hans laboratoriets protokoll för aorta SMC isolering. Finansiering av stöd tillhandahölls av National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 och R01HL133016 till D.M.G), American Heart Association (bidrag 14GRNT19990019 till D.M.G.), och Yale University (Brown-Coxe gemenskap till A.M. och start medel till D.M.G.).
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
- Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
- Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
- Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
- Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
- Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
- Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
- Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
- Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
- Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
- Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
- Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
- Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
- Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
- Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
- Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
- Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).
