استخدام في فيفو والأنسجة والخلايا Explant نهج لدراسة Morphogenesis وأمراض الشريان الاورطي الجنينية والولادة
Summary
بروتوكولات لدراسة الابهر مورين الجنينية والولادة باستخدام الاستنساخ في فيفو تحليل وتعيين مصير و explants الابهري العضلات الملساء المعزولة مفصلة الخلايا هنا. هذه النهوج المختلفة تسهيل التحقيق في morphogenesis الشريان الاورطي الجنينية والفترة المحيطة بالولادة في التطور الطبيعي والتسبب في المرض.
Abstract
الشريان الاورطي هو الشريان الأكبر في الجسم. ويتكون الجدار الابهري طبقة داخلية من خلايا بطانية وطبقة وسطى من التناوب lamellae مطاطا وخلايا العضلات الملساء (سمكس)، وطبقة خارجية الليفية والمصفوفة خارج الخلية. وعلى النقيض من هذه الدراسة على نطاق واسع من النماذج المرضية (مثل تصلب الشرايين) في الشريان الاورطي الكبار، أقل بكثير يعرف عن الشريان الاورطي الجنينية والفترة المحيطة بالولادة. وهنا، علينا أن نركز على سمكس وتوفر البروتوكولات لتحليل morphogenesis والمرضية سمكس الابهري الجنينية والفترة المحيطة بالولادة في التطور الطبيعي والمرض. على وجه التحديد، البروتوكولات الأربعة المدرجة: أنا) في فيفو مصير الجنينية رسم الخرائط والتحليل الاستنساخ؛ الثاني) الثقافة الشريان الاورطي الجنينية explant؛ ثالثا) SMC في معزل عن الشريان الاورطي الفترة المحيطة بالولادة؛ ورابعاً) وضع مضخة صغيرة ناضح تحت الجلد في الفئران الحوامل (أو غير حامل). وهكذا، هذه النهج تيسير التحقيق origin(s) ومصير، والاستنساخ بنية سمكس في الشريان الاورطي في فيفو. أنها تسمح لتحوير الشريان الاورطي الجنينية morphogenesis في الرحم بالتعرض المستمر لوكلاء الدوائية. وباﻹضافة إلى ذلك، explants الأنسجة الابهر معزولة أو سمكس الابهري يمكن استخدامها لاكتساب نظرة ثاقبة دور الجينات محددة الأهداف خلال العمليات الأساسية مثل موسكولاريزيشن، والانتشار، والهجرة. ثم يمكن تقييم هذه التجارب المدرة لفرضية سمكس معزولة والشريان الاورطي اكسبلانتيد في السياق في فيفو من خلال نهج الدوائي والوراثية.
Introduction
نظم الدورة الدموية في الكائنات الحية متعددة الخلايا الدالة توصيل المواد الغذائية والأكسجين إلى الخلايا التي ليست على اتصال بالبيئة الخارجية، وإزالة الفضلات وثاني أكسيد الكربون من هذه الخلايا. في الفقاريات، يتكون نظام الدورة الدموية الأولية من القلب، وهي مضخات الدم من خلال سلسلة من الأوعية الدموية. جدران الأوعية الدموية الكبيرة، مثل الشرايين والاوردة، وتتألف من ثلاث طبقات: أنا) البطانية، أو الطبقة الداخلية من خلايا بطانية؛ ثانيا) وسائل الإعلام، أو طبقة وسطى من التناوب circumferentially ممدود خلايا العضلات الملساء سمكس ومطاطا lamellae؛ وثالثاً) الغلالة، أو الطبقة الخارجية من النسيج الضام والليفية. الغالبية العظمى من الدراسات في علم الأحياء والأوعية الدموية تركز على خلايا بطانية، التحقيق في تشكيل أنابيب مبطنة خلية بطانية جديدة عن طريق الأوعية. وفي المقابل، تلقي سمكس اهتماما ضئيلا نسبيا. ومع ذلك، يتم سمكس نوع خلية حاسمة في بناء الجدار الشرياني طبيعي وأمراض الأوعية الدموية.
الشريان الاورطي هو الشريان عيار أكبر في الجسم، وتلقى إخراج القلب من البطين الأيسر للقلب. هي تعاني من الأمراض البشرية المتنوعة، بما في ذلك تصلب الشرايين والأوعية الدموية، والتشريح. في الكائنات الحية الكبار، الشريان الاورطي وفروعه الرئيسية درس مكثف في نماذج أمراض الأوعية الدموية. على سبيل المثال، وضع حمية الدهون عالية تغذية الفئران التي تعتبر لاغية للجينات ترميز مستقبلات low-density lipoprotein أو الابوليبوبروتين ه، تصلب الشرايين، ومصير الأخيرة رسم خرائط الدراسات تشير إلى أن تثير سمكس موجودة مسبقاً إلى أنواع متعددة من الخلايا في لوحة تصلب الشرايين1. وتشمل التغييرات المرضية في تمدد الأوعية الدموية الابهري، المبرمج SMC والمصفوفة خارج الخلية إعادة عرض2،3.
من المعروف أقل بكثير فيما يتعلق بتصريح خاص morphogenesis والمرضية أثناء فترات الولادة والجنينية. هنا، نحن نقدم البروتوكولات لدراسة الجنينية والولادة الابهري سمكس في فيفو، في explants الأنسجة والخلايا المعزولة. على سبيل المثال، القسم الأول من البروتوكول يحدد مصير رسم الخرائط والتحليل الاستنساخ في الفئران الجنينية. Recombinase Cre أعرب تحت سيطرة أحد المروجين خلية محددة يسهل تمييز خلايا معينة وعلى ذرية4،،من56؛ مع ذلك، يمكن التحكم الزمني لوضع العلامات الخاصة بالخلية الصعبة خلال التطور الجنيني في الفئران. وفي هذا السياق، مع الأجنة معربا عن كرير الشرطي تحت مروج نشط في سمكس (e.g.,Myh11 أو Acta2)، وهو مراسل لجنة المساواة العرقية، نحن توفير أساليب للحقن تاموكسيفين أو في المستقلب النشط 4-OH-التاموكسيفين في السدود الحوامل ومن أجل تحليل الخلايا المسماة في الأجنة أو ذرية بعد الولادة. وعلاوة على ذلك، خلافا لمصير دراسات رسم الخرائط، التي يغلب عليها الطابع الاستفادة من الصحفيين لجنة المساواة العرقية مع مراسل واحد فلوروفوري1،7، إلى حد كبير هو تعزيز تحليل الاستنساخ مع الصحفيين Cre متعدد الألوان.
تصف الأجزاء الثانية والثالثة من البروتوكول الأساليب لعزل واستزراع explants الابهري الجنينية وسمكس الابهري من حديثي الولادة، على التوالي. تسمح هذه النهج للتلاعب بمسارات الإشارات، على وجه التحديد في الابهر explants أو سمكس، وتحليل الآثار المباشرة لوكلاء الدوائية. وهكذا، يمكن فحص دور جينات محددة في النسيج للفائدة بطريقة سريعة أكثر بكثير مما عن طريق التلاعب الوراثية التقليدية في الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، دراسات SMC معزولة تيسير تحليل الهجرة الخلية والالتصاق، ومن الناحية الفنية محدودة فيفو.
وأخيراً، يحدد القسم البروتوكول الرابع وضع مضخة صغيرة تحت الجلد ناضح محملة بوكلاء الدوائية في الفئران الحوامل (أو غير حامل). ويسهل هذا الأسلوب تحليل الأثر على التنمية الجنينية الناجمة عن العوامل التي تتطلب التسريب المستمر بسبب التمثيل الغذائي السريع. والبديل للحقن المتكرر ليس عمليا بالنسبة للعديد من العوامل وينبغي تجنبها، كما أنه قد يسبب مشقة كبيرة في السد حامل.
Protocol
Representative Results
Discussion
على النقيض من تحقيقات واسعة النطاق في الشريان الاورطي موريني وفروعها الرئيسية في الحالات المرضية الكبار، مثل نماذج من تصلب الشرايين، المعروف أقل فيما يتعلق morphogenesis وأمراض الشريان الاورطي الجنينية والفترة المحيطة بالولادة. هنا، علينا التركيز على الشريان الاورطي الجنينية/فترة ما حول الو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر لي دين لمشاركة بروتوكول له المختبرات لعزل SMC الابهري. دعم التمويل كان المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R21NS088854، R01HL125815، و R01HL133016 إلى D.M.G)، “جمعية القلب الأمريكية” (معونات 14GRNT19990019 إلى D.M.G.)، وجامعة ييل (زمالة براون-كوكس صباحا وبدء التشغيل الأموال إلى D.M.G.).
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
- Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
- Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
- Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
- Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
- Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
- Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
- Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
- Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
- Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
- Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
- Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
- Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
- Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
- Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
- Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
- Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).
