Met behulp van In Vivo en weefsel en cel Explant benaderingen te bestuderen van de voedselproductie en de pathogenese van de embryonale en perinatale Aorta
Summary
Protocollen voor het bestuderen van de embryonale en perinatale lymfkliertest aorta met behulp van in vivo klonale analyse en lot toewijzing, aorta explantaten en geïsoleerde gladde spier cellen zijn gedetailleerd hier. Deze uiteenlopende benaderingen vergemakkelijken het onderzoek van de morfogenese van de embryonale en perinatale aorta in normale ontwikkeling en de pathogenese in ziekte.
Abstract
De aorta is de grootste slagader in het lichaam. De aorta muur bestaat uit een binnenlaag van endotheliale cellen, een middenlaag van wisselende elastische lamellen en zachte spiercellen (SMCs) en een buitenlaag van fibroblasten en extracellulaire matrix. In tegenstelling tot de wijdverbreide studie van pathologische modellen (bijvoorbeeld atherosclerose) in de volwassen aorta, is veel minder bekend over de embryonale en perinatale aorta. Hier, wij richten ons op SMCs en protocollen voor de analyse van de voedselproductie en pathogenese van embryonale en perinatale aorta SMCs in normale ontwikkeling en ziekte. In het bijzonder de vier protocollen opgenomen zijn: ik) in vivo embryonale lot mapping en klonen analyse; II) explant embryonale aorta cultuur; III) SMC isolatie van de perinatale aorta; en iv) plaatsing van de subcutane osmotische mini pomp bij zwangere (of niet-drachtige) muizen. Dus, deze benaderingen vergemakkelijken het onderzoek van de origin(s), lot en klonen architectuur van SMCs in de aorta in vivo. Zij maken voor het moduleren van embryonale aorta morfogenese in utero door voortdurende blootstelling aan een farmacologische agenten. Bovendien, geïsoleerde aorta weefsel explants of aorta SMCs inzichten te krijgen in de rol van de specifiek gen doelen tijdens fundamentele processen zoals muscularization, proliferatie en migratie kunnen worden gebruikt. Deze hypothese genererende experimenten op geïsoleerde SMCs en het transplanteren aorta kunnen vervolgens worden beoordeeld in het kader in vivo via farmacologische en genetische benaderingen.
Introduction
De bloedsomloop systems van meercellige organismen functie voor voedingsstoffen en zuurstof naar de cellen die zijn niet in contact met de externe omgeving en het verwijderen van afvalstoffen en koolstofdioxide van deze cellen. In gewervelde dieren bestaat de primaire bloedsomloop uit het hart, welke pompen bloed door middel van een reeks van bloedvaten. De muren van de grote bloedvaten zoals slagaders en aders, bestaan uit drie lagen: ik) de intima, of binnenlaag van endotheliale cellen; II) de media, of de middelste laag van wisselende omtrek langwerpige zachte spiercellen SMCs en elastische lamellen; en iii) de adventitia, of de buitenlaag van bindweefsel en fibroblasten. De overgrote meerderheid van de studies in vasculaire biologie focus op endotheliale cellen, onderzoek naar de vorming van nieuwe endothelial cel omzoomde buizen door middel van angiogenese. In vergelijking krijgen SMCs relatief weinig aandacht. SMCs zijn echter een kritische celtype in de bouw van de normale arteriële muur en vasculaire pathologieën.
De aorta is de grootste kaliber slagader in het lichaam, het ontvangen van de cardiale output van het linkerventrikel van het hart. Het wordt geteisterd door uiteenlopende ziekten bij de mens, met inbegrip van atherosclerose en aneurysma dissectie. In volwassen organismen, worden de aorta en zijn grote takken intens bestudeerd in modellen van vasculaire ziekte. Bijvoorbeeld, hoog vet dieet gevoed muizen die zijn leeg voor de codering van de low-density lipoprotein receptor of apolipoproteïne E, gene ontwikkelen van atherosclerose, en recente lot toewijzing studies blijkt dat bestaande SMCs aanleiding geven tot meerdere celtypen in de atherosclerotische plaque1. In de aorta aneurysma omvatten pathologische veranderingen SMC apoptosis en extracellulaire matrix remodelleren van2,3.
Aanzienlijk minder is gekend over SMC genuitdrukking en pathogenese tijdens de embryonale en perinatale periode. Wij bieden hier protocollen voor studeren embryonale en perinatale aorta SMCs in vivo, in weefsel explantaten en geïsoleerde cellen. Bijvoorbeeld, bakent het eerste deel van het protocol lot mapping en klonen analyse in embryonale muizen. CRE recombinase uitgedrukt onder de controle van de promotor van een cel-specifieke vergemakkelijkt de markering van de specifieke cellen en hun nageslacht4,5,6; temporele controle van cel-specifieke etikettering kan echter uitdagende zijn tijdens de embryonale ontwikkeling in muizen. In dit verband bieden met embryo’s uiting geven aan de voorwaardelijke CreER onder actief in SMCs (e.g.,Myh11 of Acta2) en een Cre-verslaggever, de promotor wij de methoden voor het injecteren van tamoxifen of zijn actieve metaboliet 4-OH-tamoxifen in zwangere dammen en voor het analyseren van de gelabelde cellen in embryo’s of postnatale nakomelingen. Bovendien, in tegenstelling tot lot toewijzing studies, waarvoor voornamelijk gebruik maken van Cre verslaggevers met een enkele verslaggever fluorophore1,7, klonen analyse is aanzienlijk verbeterd met Multi-Color Cre verslaggevers.
De tweede en derde van protocol beschreven methoden om te isoleren en kweken van embryonale aorta explantaten en aorta SMCs van pasgeborenen, respectievelijk. Deze benaderingen toestaan voor het manipuleren van signaalroutes, specifiek in de aorta explantaten of SMCs, en voor het analyseren van de directe effecten van farmacologische agenten. Zo kan de rol van specifieke genen in het weefsel van belang worden vertoond in een veel snellere manier dan door middel van traditionele genetische manipulaties in muizen. Bovendien, de geïsoleerde SMC studies vergemakkelijken de analyse van cel migratie en adhesie, die technisch beperkt in vivo.
Tot slot, de vierde protocol sectie bakent de plaatsing van een subcutane osmotische mini pomp geladen met farmacologische agenten in zwanger (of niet-drachtige) muizen. Deze methode vereenvoudigt de analyse van het effect op de ontwikkeling van het embryo veroorzaakt door agentia die continue infusie vanwege snelle stofwisseling vereisen. Het alternatief voor frequente injecties is niet praktisch voor veel agenten en moet worden voorkomen, aangezien het groot ongemak in de zwangere dam veroorzaken kan.
Protocol
Representative Results
Discussion
In tegenstelling tot het uitgebreide onderzoek van de lymfkliertest aorta en zijn grote takken in volwassen pathologische condities, zoals de modellen van atherosclerose, is minder bekend met betrekking tot de voedselproductie en de pathogenese van de embryonale en perinatale aorta. Hier, wij concentreren op de embryonale/perinatale aorta, specifiek het SMCs, en protocollen om te bestuderen van de aorta door middel van in vivo, weefsel explant, verstrekken en SMC isolatie benaderingen. Deze gratis methoden biede…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We dank Dean Li voor het delen van zijn laboratorium protocol voor aorta SMC isolatie. Financiering van de steun werd geboden door de National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 en R01HL133016 naar D.M.G), de American Heart Association (Grant-in-Aid 14GRNT19990019 naar D.M.G.), en Yale University (Brown-Coxe Fellowship aan A.M. en opstarten fondsen aan D.M.G.).
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
- Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
- Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
- Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
- Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
- Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
- Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
- Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
- Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
- Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
- Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
- Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
- Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
- Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
- Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
- Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
- Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).
