Morfogenez ve embriyonik ve Perinatal aort patogenezi okumaya vivo içinde ve doku ve hücre Explant yaklaşımları kullanma
Summary
Vivo klonal analizi ve kader eşleme, aortik explants ve izole düz kas hücreleri ayrıntılı burada kullanarak embriyonik ve perinatal fare aort eğitim için kullanılan protokol. Bu farklı yaklaşımlar normal gelişim embriyonik ve perinatal aort ve hastalık patogenezinde morfogenez incelenmesi kolaylaştırmak.
Abstract
Aort vücuttaki en büyük arter olduğunu. Aort duvar endotel hücrelerinin bir iç tabaka, elastik lamellae ve düz kas hücreleri (SMCs) alternatif bir orta katman ve fibroblastlar ve hücre dışı matriks ki dış tabakası oluşur. Patolojik modellerinde (Örneğin, ateroskleroz) Yetişkin aort yaygın bir çalışma aksine, embriyonik ve perinatal aort hakkında daha az bilinir. Burada, SMCs üzerinde ele ve embriyonik ve perinatal aort SMCs normal gelişim ve hastalığın patogenezi ve morfogenetik analizi için iletişim kuralları sağlar. Özellikle, dahil dört protokolü şunlardır: Ben) vivo embriyonik kader haritalama ve klonal analizi; II) embriyonik aort kültür explant; III) perinatal aort SMC izolasyon; ve IV) hamile (veya gebe olmayan) farelerde subkutan ozmotik Mini pompa yerleştirme. Böylece, bu yaklaşımlar origin(s), kader ve klonal SMCs mimarisinde aort içinde vivoincelenmesi kolaylaştırmak. Onlar sürekli maruz farmakolojik embriyonik aort morfogenez rahim içinde oransal için sağlar. Buna ek olarak, izole aort dokusu explants veya aort SMCs muscularization, nükleer silahların yayılmasına karşı ve göç gibi temel süreçler sırasında belirli bir gen hedefleri rolüne anlayışlar kazanmak için kullanılabilir. Bu hipotez oluşturma deneyler izole SMCs ve explanted aort sonra vivo içinde bağlamında farmakolojik ve genetik yaklaşımlar ile tespit edilebilir.
Introduction
Hücrelere besin ve oksijen sağlamak için çok hücreli organizmalar işlevinin dolaşım sistemi bu değil dış çevre ile temas ve atık ürünlerin ve karbon dioksit bu hücrelerdeki kaldırmak için vardır. Omurgalılar, birincil dolaşım sistemi hangi pompalar kan damarlarının bir dizi sayesinde kan kalp oluşur. Atar ve toplar damarlardaki, gibi büyük kan damarlarının duvarlarında üç katmandan oluşur: Ben) intima veya iç tabaka endotel hücre; II) medya veya Orta tabaka, çepeçevre alternatif düz kas hücreleri SMCs ve elastik lamellae uzamış; ve III) adventitia veya bağ dokusu ve fibroblastlar dış tabakası. Vasküler Biyoloji çalışmalarda büyük çoğunluğu yeni endotel hücre kaplı borular aracılığıyla angiogenez oluşumu soruşturma endotel hücreleri üzerinde odaklanın. Buna karşılık, nispeten az ilgi SMCs alırsınız. Ancak, SMCs normal Arteryel duvar inşası ve vasküler patolojiler kritik hücre tipi vardır.
Aort vücuttaki kalp sol ventrikül kardiyak çıkış alma en büyük kalibreli arter olduğunu. Ateroskleroz, anevrizma ve diseksiyona dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıkları dertli. Yetişkin canlılar arasında aorta ve büyük dalları yoğun damar hastalığı modellerinde incelenmektedir. Örneğin, düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör veya apolipoprotein E, kodlama gen için boş olan fareler beslenen yüksek yağlı diyet geliştirmek ateroskleroz ve kader eşleme çalışmalar gösterir önceden varolan SMCs birden fazla hücre türü için neden olmaktadır aterosklerotik plak1. Aort Anevrizmalarının patolojik değişiklikler SMC Apoptozis ve hücre dışı matriks2,3remodeling içerir.
Önemli ölçüde daha az embriyonik ve perinatal dönemlerinde SMC morfogenez ve patogenezi ile ilgili olarak bilinir. Burada, embriyonik ve perinatal aort SMCs vivo içindedoku explants ve izole hücreler eğitimi için protokolleri sağlamak. Örneğin, protokol ilk bölümünü kader haritalama ve embriyonik farelerde klonal analiz delineates. Cre recombinase bir hücre özgü organizatörü kontrolü altında ifade belirli hücreleri işaretleme ve onların döl4,5,6kolaylaştırır; Ancak, farelerde embriyonik gelişim sırasında cep özel etiketleme zamansal kontrol zor olabilir. Bu bağlamda, bir organizatörü SMCs (e.g.,Myh11 veya Acta2) ve Cre muhabir etkin altında koşullu CreER ifade embriyo ile biz tamoxifen veya onun aktif metaboliti 4-OH-tamoxifen hamile barajlar içinde enjekte için yöntemleri sağlar ve embriyo veya postnatal çoluk çocuk etiketli hücreleri analiz etmek için. Ayrıca, hangi çoğunlukla Cre gazetecilere bir tek gazeteci fluorophore1,7ile kullanmak, kader Haritalama çalışmaları aksine, klonal analiz önemli ölçüde çok renkli Cre gazetecilere ile zenginleştirilmiştir.
İletişim kuralı ikinci ve üçüncü bölümlerde izole edip embriyonik aort explants ve gelen ventilasyon, aortik SMCs sırasıyla kültür yöntemleri açıklanmaktadır. Bu yaklaşımlar sinyal yollar, özellikle aort explants veya SMCs, manipülasyon ve farmakolojik ajanların doğrudan etkileri analiz etmek için izin verir. Böylece, faiz dokusunun belirli genlerin rol farelerde geleneksel genetik manipülasyon yoluyla çok daha hızlı bir biçimde tarandı. Buna ek olarak, izole SMC çalışmalar hücre göç çözümlemesini kolaylaştıran ve teknik olarak yapışma içinde vivosınırlı.
Son olarak, dördüncü protokol bölümünde subkutan ozmotik Mini pompa hamile (veya gebe olmayan) farelerde farmakolojik ajanlar ile yüklenen yerleşimini delineates. Bu yöntem embriyonik gelişme hızlı metabolizma nedeniyle sürekli infüzyon gerektiren ajanlar nedeniyle üzerindeki etkisinin analizi kolaylaştırır. Sık iğne alternatif birçok ajanlar için pratik değildir ve o hamile baraj önemli rahatsızlık neden olabilir, kaçınılmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fare aort ve ateroskleroz, modelleri gibi yetişkin patolojik koşullarında büyük dalları geniş araştırmalar aksine daha az morfogenez ve embriyonik ve perinatal aort patogenezi ile ilgili olarak bilinir. Burada, biz embriyonik/perinatal aorta, özellikle SMCs, odak ve aort yoluyla vivo içindedoku explant, çalışmaya iletişim kuralları sağlar ve SMC yalıtım yaklaşımlar. Bu ücretsiz yaklaşımlar embriyonik/perinatal aort çalışmaya farklı yaklaşımlarla araştırmacı sağlar.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dean Li aort SMC yalıtım için onun laboratuvarı protokol paylaştığınız için teşekkür ederiz. Destek finansman sağlanan ulusal sağlık Enstitüleri tarafından (R21NS088854, R01HL125815 ve R01HL133016 D.M.G için), Amerikan Kalp Derneği (Grant-in-Aid 14GRNT19990019) D.M.G. için ve Yale Üniversitesi (kahverengi-Coxe Bursu için sabah ve başlangıç fonlar için D.M.G.).
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
- Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
- Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
- Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
- Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
- Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
- Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
- Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
- Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
- Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
- Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
- Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
- Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
- Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
- Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
- Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
- Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).
