Bruke i Vivo og vev og celle Explant tilnærminger å studere Morphogenesis og patogenesen av embryonale og Perinatal Aorta
Summary
Protokoller for å studere embryonale og perinatal murine aorta bruker i vivo klonal analyse og skjebne kartlegging, aorta explants og isolert glatt muskel celler er beskrevet her. Disse ulike tilnærmingene lette etterforskningen av morphogenesis av embryonale og perinatal aorta i normal utvikling og patogenesen ved sykdom.
Abstract
Aorta er den største arterien i kroppen. Aorta veggen består av et indre lag av endotelceller, en midterste laget av vekslende elastisk lamellae og glatte muskelcellene (SMCs) og et ytre lag av fibroblaster og ekstracellulær matrix. I motsetning til den omfattende studien av patologisk modeller (f.eks aterosklerose) i voksen aorta, er mye mindre kjent om embryonale og perinatal aorta. Her vi fokusere på SMCs og gi protokoller for analyse av morphogenesis og patogenesen av embryonale og perinatal aorta SMCs i normal utvikling og sykdom. Spesielt fire protokollene inkludert er: jeg) i vivo embryonale skjebne kartlegging og klonal analyse; II) explant embryonale aorta kultur; III) SMC isolasjon fra perinatal aorta; og iv) subkutan osmotisk mini pumpe plassering i gravid (eller ikke-gravid) mus. Dermed lette disse etterforskningen av origin(s), skjebne og klonal arkitektur SMCs i aorta i vivo. De tillater modulerende embryonale aorta morphogenesis i utero med kontinuerlig eksponering for farmakologisk agenter. I tillegg isolert aorta vev explants eller aorta SMCs kan brukes til å få innsikt i rollen som bestemte genet mål i grunnleggende prosesser som muscularization, spredning og overføring. Disse hypotese-generering eksperimenter med isolert SMCs og explanted aorta kan deretter vurderes i sammenheng i vivo gjennom farmakologiske og genetisk tilnærminger.
Introduction
Sirkulasjons systemer av multicellular organismer funksjonen å levere næringsstoffer og oksygen til cellene som er ikke i kontakt med det ytre miljøet og fjerne avfallsstoffer og karbondioksid fra disse cellene. I virveldyr består primære sirkulasjonssystemet av hjertet, som pumper blod gjennom en rekke blodkar. Veggene i store blodkar, som arteries og årer, består av tre lag: jeg) den intima, eller indre laget av endotelceller; II) i media og midterste laget av vekslende circumferentially langstrakt glatte muskelcellene SMCs og elastisk lamellae; og iii) i adventitia, eller ytre laget av bindevev og fibroblaster. Det store flertallet av studier i vaskulær biologi fokus på endotelceller, undersøker dannelsen av nye endothelial celle-lined rør gjennom angiogenese. Sammenligning motta SMCs relativt liten oppmerksomhet. Men er SMCs en kritisk celle type i byggingen av normal arterieveggen og vaskulær patologi.
Aorta er den største kaliber arterien i kroppen, mottar cardiac utgang fra venstre ventrikkel hjertet. Det er rammet av ulike menneskelige sykdommer, inkludert åreforkalkning og aneurisme disseksjon. I voksen organismer, er aortabuen og dens store grener intenst undersøkt i modeller av vaskulær sykdom. For eksempel høy fett diett matet musene som null for genet koding low-density lipoprotein reseptor eller apolipoprotein E, utvikle åreforkalkning og skjebne kartlegging studier indikerer at eksisterende SMCs gi opphav til flere celletyper i den aterosklerotisk plakk1. I aortaaneurismer inkluderer patologiske forandringer SMC apoptose og ekstracellulær matrix remodeling2,3.
Betydelig mindre er kjent om SMC morphogenesis og patogenesen i embryonale og perinatal perioder. Her gir vi protokoller for å studere embryonale perinatal aorta SMCs og i vivovev explants og isolert celler. For eksempel, delineates den første delen av protokollen skjebne kartlegging og klonal analyse i embryonale mus. Grobunn recombinase uttrykt under kontroll av en celle-spesifikke promoter muliggjør merking av bestemte celler og deres avkom4,5,6; Imidlertid kan timelige kontroll av celle-spesifikke merking være utfordrende under embryonale utviklingen i mus. I denne sammenheng gir med embryo uttrykke den betingede CreER under en pådriver i SMCs (e.g.,Myh11 eller Acta2) og en grobunn reporter, vi metoder for injeksjonsbruk tamoxifen eller den aktive metabolitten 4-OH-tamoksifen i gravid dammer og for å analysere merket cellene i embryo eller postnatal avkom. Videre, i motsetning til skjebnen kartlegging studier, som hovedsakelig bruke grobunn journalister med et enkelt reporter fluorophore1,7, klonal analyse er vesentlig forbedret med multi-farge grobunn journalister.
Den andre og tredje delen av protokollen beskriver metoder for å isolere og dyrking embryonale aorta explants og aortic SMCs fra nyfødte, henholdsvis. Disse metodene tillater for manipulering av signalveier, spesielt i aorta explants eller SMCs, og analysere de direkte virkningene av farmakologiske agenter. Dermed kan rollen til bestemte gener i vevet rundt bli vist i en langt raskere måte enn gjennom tradisjonelle genetisk manipulasjon i mus. I tillegg isolert SMC studiene forenkle analysen av celle migrasjon og vedheft, som er teknisk begrenset i vivo.
Endelig delineates den fjerde protokoll delen plasseringen av en subcutaneous osmotisk mini pumpe lastet med farmakologiske agenter i gravid (eller ikke-gravid) mus. Denne metoden muliggjør analyse av effekten på embryonale utvikling forårsaket av agenter som krever kontinuerlig infusjon på grunn av rask metabolisme. Alternativ hyppige injeksjoner er ikke praktisk for mange agenter og bør unngås, det kan forårsake betydelig ubehag i den gravide demningen.
Protocol
Representative Results
Discussion
I motsetning til omfattende undersøkelser av murine aorta og dens store grener i voksen pathological betingelser, for eksempel modeller av aterosklerose, er mindre kjent om morphogenesis og patogenesen av embryonale og perinatal aorta. Her vi fokusere på embryonale/perinatal aorta, spesielt SMCs, og gi for å studere aorta gjennom i vivo, vev explant, og SMC isolasjon tilnærminger. Disse gratis tilnærminger gir etterforsker med ulike tilnærminger til å studere embryonale/perinatal aorta.
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dean Li for deler hans laboratorium protokoll for aorta SMC isolasjon. Midler støtte ble gitt av National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 og R01HL133016 til D.M.G), American Heart Association (Grant-in-Aid 14GRNT19990019 til D.M.G.), og Yale University (Brown-Coxe fellesskap til am og oppstart midler til D.M.G.).
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
- Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
- Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
- Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
- Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
- Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
- Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
- Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
- Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
- Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
- Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
- Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
- Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
- Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
- Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
- Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
- Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).
