माउस द्वितीयक ताललेट फ्यूजन की लाइव इमेजिंग
Summary
यहां, हम कंफ़ेकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए माउस के माध्यमिक तालु संलयन के लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न प्रकार के फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस लाइनों के साथ संयोजन में और यंत्रवत् अंतर्दृष्टि के लिए पथ अवरोधकों के साथ किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल अन्य विकास प्रणालियों में लाइव इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Abstract
द्वितीयक तालाल अलमारियों का संमिश्र अक्षय माध्यमिक तालु बनाने के लिए स्तनधारी के विकास में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है और इसकी व्यवधान से ग्रस्त माध्यमिक तालु का कारण बन सकता है, जो मानवों में एक सामान्य जन्मजात विसंगति है। माध्यमिक तालु संलयन का व्यापक अध्ययन किया गया है जिससे कई प्रस्तावित सेलुलर तंत्र शामिल हो सकते हैं जो इस प्रक्रिया को मध्यस्थ बना सकते हैं। हालांकि, इन अध्ययनों का विकास के दौरान या स्थैतिक समय-समय पर विश्लेषण किए जाने वाले निश्चित व्याख्यात्मक संस्कृतियों के दौरान प्रगतिशील समय-समय पर निर्धारित भ्रूण के ऊतकों पर ज्यादातर प्रदर्शन किया जाता है। गतिशील morphogenetic प्रक्रियाओं के विश्लेषण के लिए स्थैतिक विश्लेषण सीमित है, जैसे कि एक तालु संलयन और गतिशील सेलुलर व्यवहार किस प्रकार के पैदल संबंधी संलयन में मध्यस्थता का अछालन है। यहाँ हम माउस भ्रूण में पूर्व vivo माध्यमिक तालु संलयन के लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। तालु संलयन के सेलुलर व्यवहार की जांच के लिए, एपीथेलियल -विशिष्ट केराटिन 14-कोर का उपयोग आरओएस में तालु उपकला कोशिकाओं को लेबल करने के लिए किया गया थाए 26- एमटीएमजी फ्लोक्स रिपोर्टर भ्रूण फ़िलीमेंटस एक्टिन की कल्पना करने के लिए, लाइफैक्ट-एमआरएफप्रसार रिपोर्टर चूहों का उपयोग किया गया था। माध्यमिक तालु संलयन का लाइव इमेजिंग भ्रूण के दिन (ई) के 14-चरण मंच भ्रूण और संवृद्धि का एक गिलास नीचे के डिब्बों में हाल ही में पालन किए जाने वाले माध्यमिक तालाल अलमारियों को विच्छेद करके निष्प्रभावी करके किया गया था, जो एक उलटे confocal microscope के साथ इमेजिंग को सक्षम करता है। इस पद्धति का उपयोग करते हुए, हमने माध्यमिक तालु संलयन के दौरान विभिन्न उपन्यास सेलुलर व्यवहारों का पता लगाया है। अंतरिक्ष और समय में कितने अलग-अलग सेल व्यवहार समन्वित होते हैं इसकी सराहना इस गतिशील morphogenetic प्रक्रिया की हमारी समझ के लिए काफी योगदान देता है। यह प्रोटोकॉल उत्परिवर्ती माउस लाइनों या औषधीय अवरोधकों के साथ इलाज किये जाने वाले संस्कृतियों के लिए लागू किया जा सकता है ताकि यह पता लगा सके कि द्वितीयक तालु संलयन कैसे नियंत्रित है।
Introduction
ऊतक संलयन कई अंगों के विकास में एक महत्वपूर्ण कदम है। प्रमुख मानव जन्म दोष जैसे फांक होंठ और तालु, स्पाइना बिफिडा और हृदय के विकृतियों के कारण ऊतक संलयन 1 में दोष हो सकते हैं। विकास 2 , 3 , 4 में ऊतक संलयन को नियंत्रित करने वाले सेलुलर और आणविक तंत्र की पहचान करने के लिए माउस के माध्यमिक तालु संलयन का व्यापक अध्ययन किया गया है। माउस में, द्विपक्षीय मेकिलरी प्रक्रियाओं में से प्रत्येक माध्यमिक तालाल शेल्फ के परिणाम के साथ, ई -11.5 के आसपास माध्यमिक तालु विकास शुरू होता है। तालाल अलमारियों की प्रारंभिक वृद्धि जीभ पर खड़ी होती है, लगभग E14.0 तक, जब तक, तालाल अलमारियों को जीभ के ऊपर क्षैतिज रूप से ऊंचा किया जाता है। मध्यकाल के एपिथेली का निर्माण करने वाले दो तालाल अलमारियों के एपटीथिया के बीच शारीरिक संपर्क में मध्यिकृत निर्देशित विकास परिणामई 14.5 पर अल सीम (एमईएस) मध्यवर्ती तालाल अलमारियों के बीच से मध्यवर्ती एमईएस हटाया जाना चाहिए ताकि मेसेनचिमल संगम और ई -15.5 3 द्वारा एक अक्षुण्ण, पूरी तरह से जुड़े हुए माध्यमिक तालु का विकास किया जा सके।
कैसे एक साझा उपकला एमईएस सेल परत दो अलग अलग तालाल अलमारियों के बीच बनाई गई है, और फिर मेसेनचिमल सामंजस्य को प्राप्त करने के लिए हटा दिया गया है, तालु विकास में एक केंद्रीय प्रश्न रहा है। माउस हिस्टोलॉजिकल और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) के अध्ययन, स्पष्टीकरण संस्कृति अध्ययन और कार्यात्मक माउस आनुवंशिकी प्रयोगों के आधार पर, कई मौलिक सेल व्यवहार इस प्रक्रिया में शामिल किए गए हैं। प्रत्येक पैलेटल शेल्फ के औसत दर्जे का किनारा एपिथेलियम मेई से फ़िलोपोडिया जैसे अनुमान , आरंभिक संपर्क 5 , 6 की सुविधा प्रदान करते हैं, इसके बाद एक साझा एकल एमईएस 6 , 7 में इन उपकला कोशिकाओं के बीच में अंतर होता है। परिणामस्वरूप साझा एमईएस निकालनाको तीन गैर-विशिष्ट तंत्रों द्वारा आगे बढ़ने का प्रस्ताव दिया गया है शुरुआती अध्ययनों में ऊष्मवैज्ञानिक अवलोकन और पूर्व विवो वंशावली के महत्वपूर्ण रंगों के साथ अनुरेखण से संकेत मिलता है कि एमईएस को एमईएस कोशिकाओं 8 , 9 के मेसेनचिमल संक्रमण (ईएमटी) से उपकला द्वारा हटाया जा सकता है, हालांकि हाल ही में, उपकला कोशिकाओं के आनुवांशिक वंशावली के निशान ने अनिश्चितता बढ़ा दी है मलयालम शिल्प मेसेनशिमा 10 , 11 , 12 के लिए उपकला कोशिकाओं का दीर्घकालिक योगदान। एपोपोटिक कोशिकाओं की महत्वपूर्ण संख्या, और कुछ म्यूटेंटों में उनकी संख्या में कमी जो उचित तालु संलयन से गुजरने में नाकाम रही है, ने विचार किया कि एपोपोसिस एमईएस विघटन 2 , 3 का प्रमुख चालक हो सकता है। अंत में, प्रारंभिक आधार पर पढ़ाई के आधार पर उपकला लेबलिंग और स्थैतिक अवलोकन, प्रगतिशील समय-समय पर, एमईएस कोशिकाएं11 , 13 यानोसोल और एंटेरोस्टोरियरे आयामों में पलायन करने का प्रस्ताव किया गया था, लेकिन इस तरह के गतिशील कोशिका व्यवहार प्रारंभिक रूप से अपरिपक्व थे क्योंकि वे जीना तंतुओं के ऊतक में रहते थे। हाल ही में, हम एक नए लाइव इमेजिंग पद्धति का विकास करके इन व्यवहारों का प्रत्यक्ष रूप से पालन करने में सक्षम थे, जो फ्लोटोसेंट लेबलिंग के माउस आनुवंशिक तरीकों को जोड़ती है, जिसे ट्रांटलल अलमारियों के विस्फोटक लाइव इमेजिंग के साथ मिलाया जाता है।
सबसे पहले, तालु संलयन के दौरान तालु उपकला कोशिकाओं में गतिशील सेलुलर व्यवहार की कल्पना करने के लिए, हमने Keratin14-cre चूहों 14 , 15 के साथ ROSA26- mTmG flox चूहों को पार कर एक उपकला-विशिष्ट संवाददाता माउस उत्पन्न किया। परिणामस्वरूप भ्रूण की तालु व्याख्या संस्कृति की कोंफोकल लाइव इमेजिंग ने कुछ पहले से प्रस्तावित सेलुलर व्यवहार की पुष्टि की और संलयन प्रक्रिया में उपन्यास घटनाओं की पहचान की 6 </sup>। उपकला कोशिका झिल्ली प्रोट्रूशियंस पहले सेलुलिक सेल सेल के संपर्क से पहले और उपसंहार अभिसरण द्वारा सेल अंतरण और ओनोनाल सेल विस्थापन द्वारा किया गया। विशेष रूप से, हमने यह भी पाया कि सेल एक्स्ट्रूशन, एक उपप्रभावी होमियोस्टेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने की एक प्रक्रिया, माउस का माध्यमिक तालु संलयन 6 , 16 ड्राइविंग एक प्रमुख तंत्र था। इस इमेजिंग पद्धति का उपयोग अन्य रिपोर्टर लाइनों के साथ किया जा सकता है; हम संलयन प्रक्रिया के दौरान एटिन साइटोस्केलेटल गतिशीलता की जांच करने के लिए लाइफैक्ट-एमआरएफपीआरयूबी ट्रांसजेनिक माइस 17 , 18 का उपयोग किया। अन्य संवाददाताओं को भी तालू संलयन के अन्य विशिष्ट पहलुओं का पालन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है और इस विधि को इमेजिंग की जरूरतों और सूक्ष्मदर्शी उपलब्धता के आधार पर लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोपी या कताई डिस्क इन्फ़ोकल माइक्रोस्कोपी के रूप में अनुकूलित किया जा सकता है। लाइव इमेजिंग विकास जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण बनता जा रहा है। पार्टीCularly, craniofacial morphogenesis जटिल है और चेहरे को प्रभावित करने वाले मानव जन्म दोष सामान्य हैं। इस confocal रहते इमेजिंग विधि बुनियादी विकास तंत्र के साथ ही मानव craniofacial असामान्यताओं के मूल की एक बेहतर समझ को सक्षम करने में मदद मिलेगी
Protocol
Representative Results
Discussion
3 डी अंग की खोज संस्कृति के साथ टिशू मोर्फोजेनेसिस के लाइव इमेजिंग सेलुलर प्रक्रियाओं के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकती हैं जो निश्चित ऊतक वर्गों के पारंपरिक धुंधला विश्लेषण में नहीं दिखाया …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम माध्यमिक तालु इमेजिंग के बारे में प्रारंभिक बातचीत के लिए एम। डगलस बेन्सन का धन्यवाद करते हैं। हम confocal माइक्रोस्कोपी में इमेजिंग शर्तों को समायोजित करने के लिए उनकी सहायता के लिए डेविड कास्टैनेडा-कास्टेलानोस (लेइका) और क्रिस रिएक्सन (ज़ीज़) को भी स्वीकार करते हैं। Imaris सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मात्रात्मक छवि विश्लेषण के लिए उपयोगी सुझावों के लिए हम लिन्सी हैमिल्टन (बिप्लेन) की सराहना करते हैं। यह काम एनआईएच / एनआईडीसीआर आर 001 डी 0 25887 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
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