Живая визуализация мышей
Summary
Здесь мы представляем протокол для визуализации живого изображения вторичного слияния мыши с использованием конфокальной микроскопии. Этот протокол можно использовать в сочетании с различными линиями флуоресцентных репортерных мышей, а также с ингибиторами пути для механистической проницательности. Этот протокол может быть адаптирован для живых изображений в других системах развития.
Abstract
Слияние вторичных небных стеллажей с образованием неповрежденного вторичного неба является ключевым процессом развития млекопитающих, и его разрушение может привести к расселению вторичного неба, общей врожденной аномалией у людей. Вторичный синтез неба широко изучен, что приводит к нескольким предложенным клеточным механизмам, которые могут опосредовать этот процесс. Однако эти исследования в основном проводились на фиксированных эмбриональных тканях в прогрессивные моменты времени во время развития или в фиксированных культурах эксплантатов, проанализированных в статические моменты времени. Статический анализ ограничен для анализа динамических морфогенетических процессов, таких как слияние неба, и какие типы динамического клеточного поведения опосредуют небное слияние, не полностью поняты. Здесь мы опишем протокол для реального изображения ex vivo вторичного слияния неба в эмбрионах мыши. Чтобы исследовать клеточное поведение слияния неба, эпителиальноспецифический кератин- 14 был использован для маркировки эпителиальных клеток неба в ROSА26-mTmG FLOX репортер эмбрионов. Для визуализации нитчатого актина использовались репортерные мыши Lifeact-mRFPruby . Живую визуализацию вторичного слияния неба проводили, рассекая недавно прикрепленные вторичные небные полки эмбриональных эмбрионов зародышевого дня (E) 14,5 и культивируя в агарозосодержащих средах на стеклянной донной тарелке, чтобы обеспечить визуализацию с помощью инвертированного конфокального микроскопа. Используя этот метод, мы обнаружили множество новых сотовых форм при вторичном слиянии неба. Понимание того, как четкое поведение клеток координируется в пространстве и времени, значительно способствует пониманию этого динамического морфогенетического процесса. Этот протокол может быть применен к мутантным линиям мыши или культурам, обработанным фармакологическими ингибиторами, для дальнейшего понимания того, как контролируется вторичное слияние неба.
Introduction
Слияние тканей является важным шагом в развитии нескольких органов. Основные дефекты врожденного порока человека, такие как расщелина губы и неба, расщепление позвоночника и мальформации сердца, могут быть результатом дефектов в тканевом слиянии 1 . Мышцы вторичного слияния неба широко изучались для идентификации клеточных и молекулярных механизмов, контролирующих слияние тканей в развитии 2 , 3 , 4 . У мышей развитие вторичного неба начинается примерно в районе E11.5 с выростом вторичного небного шельфа от каждого из двусторонних верхнечелюстных процессов. Первоначальный рост небных полков происходит вертикально вдоль языка, до приблизительно E14.0, и в это время небные полки поднимаются горизонтально над языком. Медиально-направленный рост приводит к физическому контакту между прилегающим эпителием двух небных полочек, образуя эпителий средней линииАль-шва (МЧС) в Е14.5. Промежуточный МЭС должен быть удален из вторичных небных стеллажей, чтобы обеспечить мезенхимальное слияние и развитие неповрежденного, полностью слитого вторичного неба по E15.5 3 .
Как общий слой эпителиальных клеток MES образуется между двумя отдельными небными полками, а затем удаляется для достижения мезенхимальной слияния, был основным вопросом развития неба. Основываясь на исследованиях гистологической и электронной микроскопии мыши (ЭМ), исследованиях культивирования эксплантатов и экспериментов по генетической генетике мыши, в этом процессе участвовали несколько фундаментальных типов клеток. Филоподийные проекции из медиального краевого эпителия MEE каждого небного шельфа облегчают начальный контакт 5 , 6 , а затем интеркаляцию этих эпителиальных клеток в общую единицу MES 6 , 7 . Удаление итоговой общей MESБыло предложено использовать три неэксклюзивных механизма. Ранние исследования с использованием гистологического наблюдения и трассировки линии ex vivo с использованием жизненно важных красителей показали, что МЭС может быть удалена эпителиальным путем к мезенхимному переходу (ЕМТ) клеток MES 8 , 9 , хотя в последнее время генетическое отслеживание линий эпителиальных клеток вызывает неопределенность в отношении Долгосрочный вклад эпителиальных клеток в меланиму небной полки 10 , 11 , 12 . Значительное количество апоптотических клеток и уменьшение их числа у некоторых мутантов, которые не проходят надлежащего слияния неба, привели к мысли, что апоптоз может быть основным фактором растворения МЭС 2 , 3 . Наконец, основываясь первоначально на исследованиях, связанных с эпителиальной маркировкой и статическим наблюдением в прогрессивные моменты времени, клетки MESБыли предложены мигрировать в орональном и переднезаднем размерах 11 , 13 , но такое динамическое поведение клеток первоначально было неподтвержденным из-за невозможности наблюдать их в живой небной ткани. Недавно мы смогли непосредственно наблюдать это поведение, разработав новую технологию визуализации изображений, которая сочетает в себе генетические методы мыши с флуоресцентной маркировкой с конфокальной жировой визуализацией эксплантированных небных стеллажей.
Во-первых, для визуализации динамического клеточного поведения в эпителиальных клетках неба во время слияния неба мы создали эпителиальную репортерную мышь, пересекая мышей ROSA26-mTmG flox с мышами 14 , 15 Keratin14-cre . Конфокальные живые изображения культивирования неба в результате образования эмбрионов подтвердили некоторые ранее предложенные клеточные поведения и выявили новые события в процессе слияния 6 </SUP>. Выдвижения эпителиальных клеточных мембран предшествовали первоначальному клеточному клеточному контакту, за которым следовала эпителиальная конвергенция путем интеркаляции клеток и смещения овальных клеток. Примечательно, что мы также обнаружили, что экструзия клеток, процесс, который, как известно, играет важную роль в эпителиальном гомеостазе, был основным механизмом, приводящим к вторичному слиянию неба 6 , 16 . Этот метод визуализации можно использовать с другими линиями репортера; Мы использовали трансгенные мыши Lifeact-mRFPruby 17 , 18 для изучения динамики цитоскелета актина во время процесса слияния. Другие репортеры могут также использоваться для наблюдения за другими конкретными аспектами слияния неба, и этот метод может быть адаптирован как к лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, так и к конфокальной микроскопии спиннингового диска в зависимости от потребностей в изображении и доступности микроскопа. Живое изображение все чаще становится краеугольным подходом в биологии развития. ПартиCularly, черепно-лицевой морфогенез является сложным, и человеческие врожденные дефекты, которые влияют на лицо, являются общими. Этот конфокальный живой метод визуализации поможет улучшить понимание основных основных механизмов развития, а также истоков черепно-лицевых аномалий человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Живое изображение морфогенеза ткани с культурой эмбрионального тела может предоставить подробную информацию о клеточных процессах, которые не могут быть показаны при обычном анализе окрашивания фиксированных участков ткани. Используя in vitro эксплантовую культуру эмбриональног?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим М. Дугласа Бенсона за начальные разговоры о вторичной визуализации неба. Мы также признаем Дэвида Кастанеду-Кастелланоса (Leica) и Криса Риекена (Zeiss) за помощь в настройке условий съемки в конфокальной микроскопии. Мы ценим Lynsey Hamilton (Bitplane) за полезные предложения по количественному анализу изображений с использованием программного обеспечения Imaris. Эта работа финансировалась NIH / NIDCR R01 DE025887.
Materials
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion – where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O’Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -. Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
