Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion
Summary
Her presenterer vi en protokoll for levende bildebehandling av musens sekundære ganefusjon ved hjelp av konfokal mikroskopi. Denne protokollen kan brukes i kombinasjon med en rekke fluorescerende reportermuslinjer, og med banehemmere for mekanistisk innsikt. Denne protokollen kan tilpasses for levende bildebehandling i andre utviklingssystemer.
Abstract
Fusjonen av de sekundære palatalhyllene for å danne den intakte sekundære ganen er en sentral prosess i utvikling av pattedyr, og forstyrrelsen kan føre til spalt sekundær gane, en vanlig medfødt anomali hos mennesker. Sekundær ganefusjon har blitt grundig studert, noe som fører til flere foreslåtte cellulære mekanismer som kan mediere denne prosessen. Imidlertid har disse studiene blitt utført hovedsakelig på faste embryonale vev ved progressive tidspunkter under utvikling eller i faste eksplosive kulturer analysert ved statiske tidspunkter. Statisk analyse er begrenset for analyse av dynamiske morfogenetiske prosesser som en ganefusjon, og hvilke typer dynamisk cellulær oppførsel medierer palatal fusjon er ufullstendig forstått. Her beskriver vi en protokoll for levende bildebehandling av ex vivo sekundær ganefusjon i musembryoer. For å undersøke cellulær oppførsel av ganefusjon ble epitel-spesifikk Keratin14- cre brukt til å merke ganeepitelceller i ROSA26-mTmG flox reporter embryoer. For å visualisere filamentøs actin ble Lifeact-mRFPruby- reportermus brukt. Levende bildebehandling av sekundær ganefusjon ble utført ved å dissekere nylig adhered sekundære palatal hyller av embryonale (E) 14.5 stadium embryoer og dyrking i agaroseholdige medier på en glassbunnskål for å muliggjøre avbildning med et invertert konfokalmikroskop. Ved å bruke denne metoden har vi oppdaget en rekke nye cellulære atferd under sekundær ganefusjon. En forståelse for hvor forskjellig celleatferd er koordinert i rom og tid, bidrar sterkt til vår forståelse av denne dynamiske morfogenetiske prosessen. Denne protokollen kan brukes på mutante muselinjer, eller kulturer behandlet med farmakologiske hemmere for ytterligere å forstå forståelsen av hvordan sekundær ganefusjon styres.
Introduction
Vevsfusjon er et viktig skritt i utviklingen av flere organer. Store menneskelige fødselsdefekter som spalt leppe og gane, spina bifida og misdannelser i hjertet kan skyldes mangler i vevsfusjon 1 . Mus sekundær gane fusjon har blitt grundig studert for å identifisere de cellulære og molekylære mekanismer som styrer vev fusjon i utvikling 2 , 3 , 4 . I musen begynner sekundær ganeutvikling på rundt E11.5 med utvækst av en sekundær palatal hylle fra hver av de bilaterale maksillære prosessene. Den første veksten av palatalhyllene foregår vertikalt langs tungen, til omtrent E14.0, på den tiden blir palatalhyllene løftet horisontalt over tungen. Medialt rettet vekst resulterer i fysisk kontakt mellom den appellerende epitel av de to palatale hyllene, som danner midtre epitheliAl seam (MES) på E14.5. Den mellomliggende MES må fjernes fra de sekundære palatale hyllene for å tillate mesenkymal sammenfylling og utviklingen av en intakt, fullstendig smeltet sekundær gane ved E15.5 3 .
Hvordan et felles epithelial MES-cellelag dannes mellom to separate palatale hyller, og deretter fjernet for å oppnå mesenkymal konfluens, har vært et sentralt spørsmål i ganeutvikling. Basert på mus histologiske og elektronmikroskopi (EM) studier, eksplante kulturstudier og funksjonelle musegenetiske eksperimenter, har flere grunnleggende celleatferd vært involvert i denne prosessen. Filopodi-lignende fremspring fra medialkantenepitelet MEE av hver palatal hylle muliggjør første kontakt 5 , 6 , etterfulgt av interkalering av disse epitelceller til en delt enkelt MES 6 , 7 . Fjerning av den resulterende delte MESHar blitt foreslått å fortsette med tre ikke-eksklusive mekanismer. Tidlige studier med histologisk observasjon og ex vivo linjesporing med vitale farger indikerte at MES kan fjernes ved epitel til mesenchymal overgang (EMT) av MES-celler 8 , 9 , men nylig har genetisk linjesporing av epitelceller økt usikkerheten om Det langsiktige bidraget fra epitelceller til palatal hylle mesenchym 10 , 11 , 12 . Signifikant antall apoptotiske celler, og en reduksjon av antallet i noen mutanter som ikke klarer å gjennomgå riktig gnagefusion, har ført til ideen om at apoptose kan være en viktig driver for MES oppløsning 2 , 3 . Til slutt, basert på studier med epitelmerking og statisk observasjon ved progressive tidspunkter, MES-cellerBle foreslått å migrere i oronasale og anteroposterior dimensjonene 11 , 13 , men slike dynamiske celleatferdigheter var i utgangspunktet ubekreftet på grunn av manglende evne til å observere dem i levende palatalvev. Nylig var vi i stand til å observere disse oppføringene direkte ved å utvikle en ny levende bildebehandling som kombinerer musegenetiske metoder for fluorescerende merking med konfokal levende bildebehandling av eksplanterte palatalhyller.
For å visualisere dynamisk cellulær oppførsel i ganeepitelceller under ganefusjon genererte vi en epitel-spesifikk reportermus ved å krysse ROSA26-mTmG floxmus med Keratin14-cre mus 14 , 15 . Konfokal levende bildebehandling av ganeeksplanteringskulturen av de resulterende embryoer bekreftet noen tidligere foreslåtte cellulære oppføringer og identifiserte nye hendelser i fusjonsprosessen 6 </sup>. Epiteliale cellemembranfremspring foregikk før første cellecellekontakt etterfulgt av epitelial konvergens ved celleinterkalering og oronasal celleforskyvning. Spesielt oppdaget vi også at celleekstrudering, en prosess som rapporterte å spille viktige roller i epithelial homeostase, var en viktig mekanisme som kjørte mus sekundær ganefusjon 6 , 16 . Denne avbildningsmetoden kan brukes med andre reporterlinjer; Vi benyttet Lifeact-mRFPruby transgene mus 17 , 18 for å undersøke aktin cytoskeletaldynamikk under fusjonsprosessen. Andre journalister kan også benyttes for å observere andre spesifikke aspekter ved ganefusjon, og denne metoden kan tilpasses enten til laserskanning av konfokal mikroskopi eller spoleplate-konfokal mikroskopi, avhengig av bildebehov og mikroskoptilgjengelighet. Live imaging blir stadig en keystone tilnærming i utviklingsbiologi. PartiCularly, kraniofacial morfogenese er kompleks og menneskelige fødselsskader som påvirker ansiktet er vanlige. Denne konfokale levemodellmetoden vil bidra til å muliggjøre en bedre forståelse av underliggende grunnleggende utviklingsmekanismer, samt opprinnelsen til menneskelige kraniofaciale abnormiteter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Levende avbildning av vevsmorfogenese med 3D organteksplanteringskultur kan gi detaljert informasjon om cellulære prosesser som ikke kan vises i konvensjonell fargingsanalyse av faste vevseksjoner. Ved å bruke in vitro eksplanterende kultur av musemuskulær sekundær gane, observerte vi flere interessante cellulære oppføringer som førte oss til å foreslå en ny mekanisme av ganefusjon som involverer epitelkonvergens og celleekstrudering.
En felles utfordring i studier av denne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker M. Douglas Benson for innledende samtaler om sekundær gane-bildebehandling. Vi anerkjenner også David Castaneda-Castellanos (Leica) og Chris Rieken (Zeiss) for deres hjelp til å justere bildeforhold i konfokal mikroskopi. Vi setter pris på Lynsey Hamilton (Bitplane) for nyttige forslag til kvantitativ bildeanalyse ved hjelp av Imaris-programvare. Dette arbeidet ble finansiert av NIH / NIDCR R01 DE025887.
Materials
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion – where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O’Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -. Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
