Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för levande avbildning av mus-sekundär palatsfusion med konfokal mikroskopi. Detta protokoll kan användas i kombination med en rad fluorescerande reportermuslinjer, och med pathway-hämmare för mekanisk inblick. Detta protokoll kan anpassas för levande bildbehandling i andra utvecklingssystem.
Abstract
Sammansmältningen av de sekundära palatalhyllorna för att bilda den intakta sekundära gommen är en nyckelprocess i däggdjursutveckling och dess störning kan leda till kluven sekundär gom, en vanlig medfödd anomali hos människor. Sekundär gomfusion har studerats omfattande, vilket leder till flera föreslagna cellulära mekanismer som kan förmedla denna process. Dessa studier har emellertid för det mesta utförts på fasta embryonala vävnader vid progressiva tidpunkter under utveckling eller i fasta explantkulturer analyserade vid statiska tidpunkter. Statisk analys är begränsad för analys av dynamiska morfogenetiska processer, såsom en palatsfusion och vilka typer av dynamiska cellulära beteenden som medier palatalfusion är ofullständigt förstådd. Här beskrivs ett protokoll för levande avbildning av ex vivo sekundärpalatsfusion i musembryon. För att undersöka cellulära beteenden av gommen fusion användes epithelial-specifik Keratin14- cre för att märka gomepitelceller i ROSA26-mTmG Flox reporter embryon. För att visualisera filamentöst aktin användes Lifeact-mRFPruby- reportermöss. Levande bildbehandling av sekundär palatsfusion utfördes genom att dissekera nyligen adhererade sekundära palatalhyllor av embryonala (E) 14.5-stegsembryon och odling i agaroshaltiga medier på en glasskål för att möjliggöra avbildning med ett inverterat konfokalmikroskop. Med hjälp av denna metod har vi upptäckt en mängd nya cellulära beteenden under sekundär palatsfusion. En uppskattning av hur distinkt cellbeteende samordnas i rymden och tiden bidrar mycket till vår förståelse av denna dynamiska morfogenetiska process. Detta protokoll kan appliceras på mutanta muslinjer eller kulturer behandlade med farmakologiska hämmare för att ytterligare förstå förståelse för hur sekundär palatsfusion kontrolleras.
Introduction
Vävnadsfusion är ett viktigt steg i utvecklingen av flera organ. Huvudsakliga mänskliga fosterskador som klyvtapp och gom, spina bifida och missbildningar av hjärtat kan bero på brister i vävnadsfusion 1 . Mus sekundär gommen fusion har studerats omfattande för att identifiera de cellulära och molekylära mekanismerna som kontrollerar vävnadsfusion i utveckling 2 , 3 , 4 . I muskeln börjar sekundär gommen utveckling runt E11.5 med utväxten av en sekundär palatalhylla från varje bilateral maxillärprocess. Initial tillväxt av palatalhyllorna sker vertikalt längs tungan, tills ungefär E14.0, vid vilken tidpunkt palatalhyllorna höjs horisontellt över tungan. Medialt riktad tillväxt resulterar i fysisk kontakt mellan epithelernas tillhörande epitel i de två palatala hyllorna, som bildar mittlinjen epitheliAl seam (MES) vid E14.5. Den mellanliggande MES måste avlägsnas från mellan de sekundära palatalhyllorna för att möjliggöra mesenkymkonfluens och utvecklingen av en intakt, fullständigt smält sekundär gommen genom E15.5 3 .
Hur en gemensam epitelial MES-cellskikt bildas mellan två separata palatala hyllor och sedan avlägsnas för att uppnå mesenkymkonfluens har varit en central fråga vid gomutveckling. Baserat på mus histologiska och elektronmikroskopi (EM) studier, explant kulturstudier och funktionella musgenetiska experiment har flera grundläggande cellbeteenden varit inblandade i denna process. Filopodia-liknande utsprång från medialkanten epitel MEE av varje palatalhylla underlättar initial kontakt 5 , 6 följt av interkalering av dessa epitelceller till en gemensam singel MES 6 , 7 . Avlägsnande av den resulterande delade MESHar föreslagits att fortsätta med tre icke-exklusiva mekanismer. Tidiga studier som använde histologisk observation och ex vivo linjespårning med vitala färgämnen indikerade att MES kan avlägsnas genom epitel till mesenkymal övergång (EMT) hos MES-celler 8 , 9 , men nyligen har genetisk linjär spårning av epitelceller ökat osäkerheten med avseende på Det långsiktiga bidraget från epitelceller till palatalhylsan mesenchym 10 , 11 , 12 . Signifikant antal apoptotiska celler och en minskning av deras antal i vissa mutanter som misslyckas med att genomgå riktig palatsfusion har lett till tanken att apoptos kan vara en viktig drivkraft för MES-upplösning 2 , 3 . Slutligen baseras initialt på studier som involverar epitelmärkning och statisk observation vid progressiva tidpunkter, MES-cellerFöreslogs att migrera i oronasala och anteroposterior dimensionerna 11 , 13 , men sådana dynamiska cellbeteenden var initialt okontrollerade på grund av en oförmåga att observera dem i levande palatal vävnad. Nyligen kunde vi direkt observera dessa beteenden genom att utveckla en ny levande bildhanteringsmetodik som kombinerar musegenetiska metoder för fluorescerande märkning med konfokal levande bildbehandling av explanted palatal hyllor.
Först, för att visualisera dynamiska cellulära beteenden i gom epitelceller under gommen fusion, genererade vi en epitelial specifika reporter mus genom att korsa ROSA26-mTmG flox möss med Keratin14-cre möss 14, 15. Konfokal levande avbildning av palat explant kultur av de resulterande embryon bekräftade några tidigare föreslagna cellulära beteenden och identifierade nya händelser i fusionsprocessen 6 </sup>. Epitelcellsmembranutskjutningar föregick initial cellcellkontakt följt av epitelial konvergens genom cellinterkallering och oronascellförskjutning. I synnerhet upptäckte vi också att cellsträngsprutning, en process som rapporterades spela viktiga roller i epitelial homeostas, var en viktig mekanism för att driva musens sekundära palatsfusion 6 , 16 . Denna bildmetod kan användas med andra reporterlinjer; Vi utnyttjade Lifeact-mRFPruby- transgena möss 17 , 18 för att undersöka aktins cytoskeletaldynamik under fusionsprocessen. Andra journalister kan också användas för att observera andra specifika aspekter av gomfusion, och denna metod kan anpassas antingen till laserskanning av konfokal mikroskopi eller för spin-disk-konfokal mikroskopi beroende på bildbehov och tillgänglighet av mikroskop. Levande bildbehandling blir alltmer en keystone-strategi i utvecklingsbiologi. PartiCularly, kraniofacial morfogenes är komplex och mänskliga fosterskador som påverkar ansiktet är vanliga. Denna konfokala levande avbildningsmetod kommer att bidra till att möjliggöra en bättre förståelse av underliggande grundläggande utvecklingsmekanismer såväl som ursprung för mänskliga kraniofaciella abnormiteter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Levande avbildning av vävnadsmorfogenes med 3D-organexplanteringskulturen kan ge detaljerad information om cellulära processer som inte kan visas i konventionell färganalys av fasta vävnadssektioner. Genom att använda in vitro- explant-kulturen av mus-embryonala sekundärpalats, observerade vi flera intressanta cellulära beteenden som ledde oss att föreslå en ny mekanism av palatsfusion som innefattar epitelkonvergens och cellsträngsprutning.
En gemensam utmaning i studier …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar M. Douglas Benson för första samtal om sekundär gombildning. Vi erkänner också David Castaneda-Castellanos (Leica) och Chris Rieken (Zeiss) för deras hjälp att anpassa bildförhållanden i konfokal mikroskopi. Vi uppskattar Lynsey Hamilton (Bitplane) för användbara förslag på kvantitativ bildanalys med hjälp av Imaris-programvaran. Detta arbete finansierades av NIH / NIDCR R01 DE025887.
Materials
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion – where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O’Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -. Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
