Toll benzeri Reseptör Sinyali Önleyicileri İçin Fagositik Bağışıklık Hücrelerinde Biyoaktif Nanopartiküllerin Taranması
Summary
Toll benzeri reseptör (TLR) sinyali birçok insan iltihaplı hastalığın patofizyolojisinde önemli bir rol oynamaktadır ve biyoaktif nanoparçacıklar ile TLR yanıtlarının düzenlenmesinin pek çok iltihaplanma koşulunda faydalı olacağı öngörülmektedir. THP-1 hücre bazlı raportör hücreleri, TLR sinyallemesinin yeni inhibitörlerini tanımlamak için çok yönlü ve sağlam bir tarama platformu sağlar.
Abstract
Toll benzeri reseptör (TLR) yanıtlarının farmakolojik olarak düzenlenmesi birçok iltihaplı hastalığın tedavisinde umut vaat ediyor. Bununla birlikte, şimdiye kadar TLR sinyalini zayıflatmak için sınırlı bileşikler mevcuttu ve klinik kullanımda klinik olarak onaylanmış TLR inhibitörleri (sıtma önleyici ilaç olan hidroksiklorokin hariç) henüz mevcut değildi. Nanoteknolojideki hızlı gelişmeler ışığında, nano-cihazları kullanarak bağışıklık tepkisi manipülasyonu, bu hastalıkları tedavi etmek için yeni bir strateji sağlayabilir. Burada, fagositik immün hücrelerde TLR sinyalini inhibe eden yeni biyoaktif nanoparçacıkların hızla tanımlanması için yüksek verimli bir tarama yöntemi sunuyoruz. Bu tarama platformu, kolorimetrik ve lusiferaz tahlilleriyle THP-1 hücre bazlı raportör hücreler üzerine kurulmuştur. Muhabir hücreler iki tetikleyici muhabir yapısının stabil entegrasyonu ile insan THP-1 monositik hücre hattından üretilir. Birincisi, salınmış bir embriyonik alkalin fosfataz (SEAP) genini ifade ederTranskripsiyon faktörleri NF-κB ve AP-1 tarafından indüklenebilir bir promotörün kontrolü altındadır ve diğeri, interferon düzenleyici faktörler (IRF'ler) tarafından indüklenebilir promotörlerin kontrolü altında salgılanmış bir lüsiferaz raporlayıcı geni ifade eder. TLR uyarımı ile, muhabir hücreleri harekete geçirir Transkripsiyon faktörleri üretmek ve daha sonra ilgili substrat reaktiflerini kullanarak tespit edilebilen SEAP ve / veya lusiferaz üretmektir. Önceki çalışmalarımızda örnek olarak verilen peptid-altın nanopartikül (GNP) hibritlerinin bir kütüphanesini kullanarak, prototipik ligand olan lipopolisakkarid (LPS) tarafından tetiklenen TLR4 sinyal zincirinin iki kolunu etkin bir şekilde engelleyebilen bir peptid-GNP hibridi tespit ettik. Bulgular immünoblotlama da dahil olmak üzere standart biyokimyasal tekniklerle doğrulanmıştır. Daha fazla analiz, bu kurşun melezin TLR2, 3, 4 ve 5 dahil olmak üzere birden fazla TLR yolağı üzerinde etkili geniş bir inhibitör spektruma sahip olduğunu tespit etti. Bu deneysel yaklaşım, whethe'in hızlı bir değerlendirilmesine olanak tanırRa nanopartikül (veya diğer terapötik bileşikler), fagositik bağışıklık hücrelerinde spesifik TLR sinyallemesini modüle edebilir.
Introduction
Toll benzeri reseptörler (TLR'ler) doğuştan gelen bağışıklık sisteminin enfeksiyonlara karşı savunmanın ilk safhasına katkıda bulunan en önemli unsurlardan biridir. TLR'ler, patojenle ilişkili moleküler kalıpların (veya PAMP'lerin) bir repertuarını tanıyarak ve bir dizi sinyal iletimi ile savunma reaksiyonlarını monte ederek işgalci patojenleri algılamaktan sorumludur 1 , 2 . Tanımlanan 10 insan TLR'si vardır; Ligand (lar) ın belirsiz kaldığı TLR10 hariç, her bir TLR farklı, korunmuş bir PAMP grubunu tanıyabilir. Örneğin, öncelikle hücre yüzeyi üzerinde bulunan TLR2 ve TLR4, sırasıyla Gram-pozitif ve Gram-negatif bakterilerden lipoproteinleri ve glikolipitleri tespit edebilir; Başlıca endozom bölmelerinde bulunan TLR3, TLR7 / 8 ve TLR9, RNA ve DNA ürünlerini virüslerden ve bakterilerden algılayabilir 3 . PAMP'lar tarafından uyarıldığında TLR'ler, pro-inf salınarak gerekli immün yanıtları tetiklerLammatuvar mediatörler, efektör immün hücrelerini işe alma ve aktive etme ve müteakip adaptif bağışıklık olaylarını koordine etme 4 .
TLR sinyal iletimini basitçe iki ana yola 5 , 6 sınıflandırabilirsiniz. Biri bağdaştırıcı protein miyeloid farklılaşma faktörü 88'e (MyD88) bağımlıdır – MyD88'e bağımlı yolağı. TLR3 dışındaki tüm TLR'ler aktive B hücrelerinin (NF-κB) ve mitojen ile ilişkili protein kinazların (MAPK'lar) nükleer faktör kappa hafif zincir arttırıcıyı aktive etmek için bu yolu kullanır ve bu da TNF-α gibi pro-inflamatuar mediatörlerin ekspresyonuna yol açar. Α, IL-6 ve IL-8. İkinci yol, interferon (IFN) düzenleyici faktörleri (IRF'ler) ve NF-κB'yi aktive etmek için TIR-alanını içeren bağdaştırıcıyı uyaran interferon-β (TRIF) – TRIF'ye bağımlı veya MyD88'den bağımsız yol – kullanır ve sonuç olarak Tip I IFN'ler. Bozulmamış TLR sinyali vermeMikrobik ve viral enfeksiyonlardan günlük koruma için kritik önem taşır; TLR sinyal yolaklarındaki kusurlar bağışıklık yetersizliğine yol açabilir ve genellikle insan sağlığına zararlıdır. 7
Bununla birlikte, TLR sinyallemesi 'çift taraflı bir kılıç' ve aşırı kontrolsüz TLR aktivasyonu zararlıdır. Aşırı aktif TLR yanıtları birçok akut ve kronik insan iltihaplı hastalıklarda patogeneze katkıda bulunur 8 , 9 . Sistemik inflamasyon ve çoklu organ yaralanması ile karakterize edilen, örneğin, sepsis için TLR2 ve TLR4 sepsis patofizyolojisinde 10, 11, 12 çok önemli bir rol oynayan, enfeksiyon doğru akut, ezici bağışıklık tepkilerinin en başta gelen nedeni. Buna ek olarak, TLR5'in kistik fibrozisli hastaların kronik akciğer inflamasyonuna katkıda bulunduğu bulunmuştur 13, 14 . Ayrıca, düzeni bozulmuş endozomal TLR sinyalinin (örneğin, TLR7 ve TLR9) kuvvetli sistemik lupus eritematozus (SLE), romatoid artrit (RA), 15, 16 dahil olmak üzere birçok otoimün hastalıkların gelişimi ve ilerlemesinde ile ilişkilidir. Bu yakınsayan kanıt çizgileri, birçok iltihaplı hastalık için potansiyel bir terapötik hedef olarak TLR sinyalini tanımlar 17 .
TLR yanıtın farmakolojik düzenleme birçok enflamatuar koşullarda faydalı olması beklenmektedir, ancak ne yazık ki, şu anda TLR 9, 17, 18 sinyal inhibe etmek için klinik olarak kullanılabilir, çok az sayıda bileşik mevcuttur. Bu kısmen bağışıklık homeostazı ve hastalık patolojisinde yer alan TLR yolaklarının karmaşıklığı ve fazlalığından kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, yeni, poten aramakBirden fazla TLR sinyal yolunu hedefleyen terapötik ajanlar, temel bir boşluğu kapatabilir ve TLR inhibitörlerinin kliniğe ilerletilmesi zorluğunu aşabilir.
Nanobilim ve nanoteknolojideki hızlı gelişmeler ışığında, nanodeviler 19 , 20 , 23 benzersiz özelliklerinden dolayı yeni nesil TLR modülatörleri olarak ortaya çıkıyor. Nano ölçekli boyut, bu nano-terapötiklerin daha iyi biyolojik dağılımı ve sürekli dolaşımını sağlar 24 , 25 , 26 . Arzu edilen farmakodinamik ve farmakokinetik profilleri 27 , 28 , 29 karşılayacak şekilde daha da işlevsel hale getirilebilirler. Daha heyecan verici biçimde, bu yeni nanodevitelerin biyo-aktivitesi, kendilerine özgü özelliklerinden ortaya çıkmaktadır; bunlar,Sadece terapötik bir madde için bir verme aracı olarak hareket etmek yerine, Örneğin, yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) benzeri bir nanoparçacık, TLR4 ligandı LPS 23'ü süpürerek TLR4 sinyalini inhibe etmek üzere tasarlandı. Buna ek olarak, süslenmiş peptitlerin altın nanopartiküllerinin yüzey özelliklerini değiştirebilecekleri bir peptit-altın nanopartikül hibrid sistemi geliştirdik ve çeşitli biyolojik etkinliklere 30 , 31 , 32 , 33 sahip olmalarını sağladık. Bu, onları yeni nesil nano-terapötik maddeler olarak özel bir ilaç sınıfı (veya "nano-ilaç") haline getirir.
Bu protokolde, fagositik immün hücrelerdeki çoklu TLR sinyal yolaklarını güçlü bir şekilde inhibe edebilen yeni bir peptit-altın nanopartikül (peptid-GNP) hibrid sınıfı tanımlamak için bir yaklaşım sunuyoruz 32 , </suP> 33 . Yaklaşım, piyasada bulunan THP-1 raportör hücre çizgilerine dayanıyor. Muhabir hücreler, iki istikrarlı, uyarılabilir raportör yapılardan oluşur: biri, transkripsiyon faktörleri NF-κB ve aktivatör protein 1 (AP-1) tarafından indüklenebilir bir promotörün kontrolü altında bir salgılanan embriyonik alkalin fosfataz (SEAP) geni taşır; Diğeri, interferon düzenleyici faktörler (IRF'ler) tarafından indüklenebilir promotörlerin kontrolü altında bir salgılanan lüsiferaz raportör geni ihtiva eder. TLR uyarımı üzerine, sinyal iletimi, muhabir genlerini SEAP ve / veya lusiferaz haline getiren NF-κB / AP-1 ve / veya IRF'lerin aktivasyonuna yol açar; Bu gibi olaylar, bir spektrofotometre veya luminometre ile karşılık gelen substrat reajanları kullanarak kolayca tespit edilebilir. Bu yaklaşımı kullanarak önceden kurulmuş peptid-GNP melez kitaplıklarımızı taramak için, TLR4 sinyal yollarını güçlü bir şekilde önleyebilecek kurşun adaylarını tespit ettik. Kurşun peptit-polimerazın önleyici aktivitesi,GNP melezleri daha sonra immünoblotlama için başka bir biyokimyasal yaklaşım kullanılarak doğrulandı ve diğer TLR yolakları üzerinde değerlendirildi. Bu yaklaşım, TLR sinyal yollarını hedefleyen yeni ajanların hızlı ve etkili bir şekilde taranmasına izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
TLR'ler birçok iltihaplı hastalığın patogenezinde yer aldığından, immün yanıtların ve inflamatuar koşulların modülasyonu için terapötik hedefler olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, TLR sinyal yollarını inhibe etmek için kullanılan terapötiklerin klinik gelişimi bugüne kadar sınırlı bir başarı elde etmiştir. TLR7 ve TLR9 inhibe antimalarial hidroksiklorokin, klinik kullanım 35 36'dır. Benzer şekilde, klinik önc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Şanghay İlk Halk Hastanesi (HY) 'dan başlama fonu olan Şanghay Yüksek Öğrenim Enstitülerinde (HY) Özel Randevu (Doğu Edebiyatı) Profesörü, Şanghay Jiaotong'dan Gaofeng Klinik Tıp Hibe desteği için verilen programın desteğini kabul etmek istiyorlar University School of Medicine (HY) ve Crohn's ve Colitis Foundation of Canada (CCFC) (SET ve HY) tarafından finanse edildi.
Materials
| THP-1-XBlue reporter cell | InvivoGen | thpx-sp | keep cell culture passage under 20 |
| THP-1-Dual repoter cell | InvivoGen | thpd-nfis | keep cell culture passage under 20 |
| RPMI-1640 (no L-glutamine) | GE Health Care | SH30096.02 | Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10 |
| Fetal bovine serum (qualified) | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | Heat inactivated; 10% in RPMI-1640 |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | 2 mM in the complete medium R10 |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM in the complete medium R10 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium | GE Health Care | SH30028.02 | Use for cell washing and reagent preparation |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | SEAP substrate |
| QUANTI-Luc | InvivoGen | rep-qlc2 | Luciferase substrate |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Blasticidin | InvivoGen | anti-bl-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | D8418-100ML | Use for reagent preparation |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | P1585-1MG | Use for cell differentiation |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | TLR4 ligand |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | TLR2/1 ligand |
| Poly (I:C) HMW | InvivoGen | tlrl-pic | TLR3 ligand |
| Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure | InvivoGen | tlrl-epstfla | TLR5 ligand |
| SpectraMax Plus 384 microplate reader | Molecular Devices | N/A | Read colorimetric assay |
| Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors | Tecan | N/A | Read luminiscience |
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g) |
| Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use) |
| Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated | Corning Costar | 3903 | Used for luminiscence assay |
References
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
- Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
- Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).
- Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).
- Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461 (2014).
- Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).
- Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
- Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).
- O’Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).
- Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22 (5), 403-409 (2004).
- Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).
- Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29 (3), 315-321 (2008).
- Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).
- Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).
- Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265 (2014).
- Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).
- Hennessy, E. J., Parker, A. E., O’Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).
- Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).
- Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).
- Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).
- Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
- Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. , (2016).
- Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
- He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
- Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
- Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6 (9), e24374 (2011).
- Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).
- Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).
- Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).
- Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).
- Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).
- Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).
- Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).
- Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).
- Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).
- Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).
- Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).
