IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) is een Ser/Thr proteïne kinase dat in een horde van cellulaire activiteiten voornamelijk via activering van NF-recombination transcriptiefactoren betrokken is. Hier beschrijven we de belangrijkste stappen die nodig zijn voor de productie en de crystal structuurbepaling van dit eiwit.
Een klasse van extracellulaire stimuli vereist activering van IKK1/α voor het opwekken van de generatie van een NF-recombination subeenheid, p52, door verwerking van haar voorloper p100. P52 fungeert als een homodimer of heterodimer met een ander NF-recombination subeenheid, RelB. Deze Dimeren reguleren op hun beurt de expressie van genen die betrokken zijn bij ontsteking, overleving van de cel en celcyclus honderden. IKK1/α blijft voornamelijk geassocieerd met IKK2/β en NEMO als een ternaire complex. Een klein zwembad voor het wordt echter ook als een laag molecuulgewicht complex(es) waargenomen. Het is onbekend of de p100 verwerking activiteit wordt geactiveerd door activering van IKK1/α binnen het grotere of het kleinere complex zwembad. Constitutieve activiteit van IKK1/α is geconstateerd in de verschillende vormen van kanker en ontstekingsziekten. Om te begrijpen van het mechanisme van activering van IKK1/α en het gebruik ervan als een drug target inschakelt, we recombinante IKK1/α uitgedrukt in verschillende hostsystemen, zoals E. coli, insect, en zoogdiercellen. Gelukt insect cellen, verkrijgen van mg hoeveelheden van zeer zuivere eiwitten, het kristalliseren in aanwezigheid van Remmers, en voor het vaststellen van zijn X-ray kristalstructuur uiting van oplosbare IKK1/α in baculovirus besmet. Hier beschrijven we de gedetailleerde stappen voor het produceren van de recombinant eiwit, haar kristallisatie en vastbesloten met X-ray kristal structuur.
Transcriptionele activiteiten van de NF-recombination familie van dimeric transcriptiefactoren zijn vereist voor diverse cellulaire functies variërend van ontsteking en immuniteit tot overleving en dood. Deze activiteiten worden strikt gecontroleerd in cellen en een verlies van verordening leidt tot verscheidene pathologische condities, zoals auto-immune aandoeningen en kanker1,2,3. Bij het ontbreken van een stimulans, worden de activiteiten van NF-recombination geremde IκB (remmer van – recombination) eiwitten4bewaard. De fosforylatie van specifieke Ser residuen op IκB eiwitten markeert ze voor ubiquitination en aantasting van de latere remmen of selectieve verwerking5. Twee zeer homologe Ser/Thr kinases, IKK2/β en IKK1/α, fungeren als centrale regulatoren van NF-recombination activiteiten door het uitvoeren van deze fosforylatie gebeurtenissen6,7.
Interacties tussen een ligand en een receptor transduces een signaal door een reeks van bemiddelaars die leiden tot de activering van NF-recombination factoren. De NF-recombination seingeving proces kan globaal worden ingedeeld in twee afzonderlijke trajecten-canonieke en niet-canonieke (alternatieve)8. De activiteit van IKK2/β regelt voornamelijk de NF-recombination signalering van het canonieke leertraject dat essentieel is voor inflammatoire en aangeboren immuunresponsen9. Een duidelijk kenmerk van dit traject is een snelle en kortstondige activering van IKK2/β10 binnen een tot nu toe biochemically genfunctieonderzoek IKK complexe — geacht te worden samengesteld uit IKK1 en IKK2, evenals een regelgevende component, NEMO (NF-recombination essentiële Modulator )11,12,13. Tussen de twee katalytische IKK subeenheden van het complex IKK, IKK2 is voornamelijk verantwoordelijk14 voor de fosforylatie van bepaalde residuen van prototypische IκBs (α en -β, γ-) gebonden aan NF-recombination, en ook een atypische IκB eiwit, NF-κB1/p105, die een voorloper van de NF-recombination p50 subeenheid5. Fosforylering geïnduceerde ubiquitination en remmen de afbraak van IκB (of verwerking van p105) leidt tot de release en de activering van een bepaalde set van NF-recombination Dimeren15. Aberrant NF-recombination activiteit als gevolg van verkeerd gereglementeerde functie van IKK2 heeft waargenomen bij veel kankers zo goed zoals auto-immune aandoeningen2,3,16.
In tegenstelling tot IKK2/β regelt de activiteit van IKK1/α NF-recombination signalering van de niet-canonieke pathway, die essentieel is voor ontwikkeling en immuniteit. IKK1 kinaseenzym specifieke residuen van NF-κB2/p100 op haar C-terminal IκBδ-segment, wat tot de verwerking en de generatie van p52 leidt. De vorming van transcriptionally actieve p52:RelB heterodimer initieert een langzaam en duurzaam antwoord op ontwikkelingsstoornissen signalen7,17,18,19,20. Interessant, is de generatie van de centrale NF-recombination factor p52 van dit traject kritisch afhankelijk van een andere factor, NF-recombination inducerende Kinase (NIK)21,22, maar niet op IKK2 of NEMO. In rustende cellen blijft het niveau van NIK laag vanwege haar constante proteasoom-afhankelijke degradatie23,24,25. Bij stimulatie van cellen door ‘niet-canonieke’ liganden, en in bepaalde kwaadaardige cellen, NIK wordt gestabiliseerd te werven en te activeren IKK1 / α. Kinase activiteiten van zowel de IKK1 als de NIK zijn essentieel voor een efficiënte verwerking van p100 in p527. IKK1 en NIK phosphorylate drie serines (Ser866, 870 en 872) van NF-κB2/p100 op zijn segment van de C-terminal IκBδ wat leidt tot de verwerking en de generatie van p52. Aberrant activering van de niet-canonieke pathway heeft betrokken bij vele maligniteiten waaronder multiple myeloma26,27,28.
Verscheidene zeer efficiënte en specifieke remmers voor IKK2/β zijn bekend, hoewel niemand tot nu toe hebben bleek te zijn een effectieve drug. In tegenstelling, zijn IKK1/α-specifieke remmers schaars. Dit kan het gevolg zijn deels van ons gebrek aan structurele en biochemische informatieover IKK1/α, waardoor ons begrip van de mechanistische basis van activering van NF-recombination door IKK1 in cellen, en rationele drug design wordt beperkt. De X-ray structuren van IKK2/β voorzien ons van inzichten in het mechanisme van de activering van IKK2/β29; echter, deze structuren niet kon onthullen hoe verschillende upstream prikkels activeren activering van IKK1/α of IKK2/β voor het regelen van verschillende sets van NF-recombination activiteiten 30,31. Om te begrijpen de mechanistische basis ten grondslag liggen aan de duidelijke signaalfunctie van IKK1/α, en om een platform voor rationele drug design, we gericht op het bepalen van de structuur van IKK1/α.
Productie, kristallisatie en structuur oplossing van twee verwante IKK eiwitten
We bepalen de X-ray kristalstructuur van IKK1/α met de gedachte dat het een relatief eenvoudige oefening gezien onze ervaring met IKK2/β eiwitproductie, kristallisatie en structuurbepaling zou zijn uiteengezet. Maar waren we zeer verrast dat deze twee verwante proteïnen heel anders met betrekking tot het gemak van kristallisatie gedragen. Ondanks pogingen van verschillende spraakmakende laboratoria nam de bepaling van d…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken het personeel van de straallijnen 19ID, 24ID en 13ID bij de geavanceerde Photon bron, Lemont, IL, voor ondersteuning tijdens het verzamelen van de gegevens op verschillende kristallen. Wij zijn dankbaar aan Dmitry Lyumkis, Salk Instituut voor het ophalen van de lage resolutie cryo-EM kaart in vroege stadia van EM kaart/modelbouw, die werd gebruikt om de eerste IKK1 moleculaire vervanging zoeken model te bouwen. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van NIH grants AI064326, CA141722 en GM071862 naar GG. SP is momenteel een Wellcome Trust DBT India tussenliggende Fellow.
Cellfectin/Cellfectin II | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II |
Sf900 III Insect cell medium | Thermo Fisher Scientific | 12658-027 | |
SF9 cells | Thermo Fisher Scientific | 12659017 | |
anti-IKK1 antibody | Novus Biologicals | NB100-56704 | Previously sold by Imgenex |
anti-PentaHis antibody | Qiagen | 34460 | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Nitrocellulose can also be used |
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
Bradford assay reagent | BioRad | 500001 | |
Superdex 200 column | GE Healthcare | 28989335 | |
Amicon concentrator | Millipore | UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024 | |
Compound A | Bayer | ||
Calbiochem IKK-inhibitor XII | Calbiochem | 401491 | |
Staurosporine | SIGMA | S4400 | |
MLN120B | Millenium | Gift item | |
AMPPNP | SIGMA | A2647 | |
Dextran sulfate | SIGMA | 51227, 42867, 31404, | |
Dextran sulfate | Alfa Aesar | J62101 | |
PEG | SIGMA | 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 | Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #. |
Crystallization Screens | |||
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) | Hampton Research | HR2-130 | |
Index HT | Hampton Research | HR2-134 | |
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) | Hampton Research | HR2-139 | |
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) | Hampton Research | HR2-086 | |
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) | Hampton Research | HR2-136 | |
Crystal mounts | Hampton Research | HR8-188, 190, 192, 194 | |
Synchrotron | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory | Beamline 19 ID | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines. |