IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) è una proteina di Ser/Thr chinasi che è coinvolto in una miriade di attività cellulari principalmente attraverso l’attivazione di fattori di trascrizione NF-κB. Qui, descriviamo i principali passaggi necessari per la produzione e la determinazione di struttura di cristallo di questa proteina.
Una classe di stimoli extracellulari richiede l’attivazione di IKK1/α per indurre la generazione di una subunità di NF-κB, p52, attraverso l’elaborazione del suo precursore p100. P52 funzioni come un omodimero o un eterodimero con un’altra subunità di NF-κB, RelB. Questi dimeri a loro volta regolano l’espressione di centinaia di geni coinvolti nel ciclo cellulare, la sopravvivenza delle cellule e l’infiammazione. IKK1/α rimane principalmente associato con IKK2/β e NEMO come un complesso ternario. Tuttavia, una piccola piscina di esso inoltre è osservata come un complex(es) di basso peso molecolare. Non è noto se l’attività di elaborazione p100 è attivato dall’attivazione di IKK1/α all’interno il più grande o più piccola piscina complessa. Attività costitutiva di IKK1/α è stato rilevato in diversi tumori e malattie infiammatorie. Per capire il meccanismo di attivazione di IKK1/α e consentirne l’utilizzo come un bersaglio di farmaci, abbiamo espresso IKK1/α ricombinante in sistemi host diversi, quali Escherichia coli, insetto e cellule di mammifero. Siamo riusciti a esprimere solubile IKK1/α in baculovirus infetta cellule di insetto, ottenere quantitativi di mg di proteina altamente pura, si cristallizzano in presenza di inibitori e determinare la sua struttura cristallina ai raggi x. Qui, descriviamo la procedura dettagliata per produrre la proteina ricombinante, sua cristallizzazione e sua determinazione di struttura di cristallo dei raggi x.
Attività trascrizionali della famiglia di fattori trascrizionali dimerica NF-κB sono necessari per diverse funzioni cellulari, che vanno da infiammazione ed immunità alla sopravvivenza e morte. Queste attività sono rigorosamente controllate nelle cellule e una perdita di regolamento porta a varie circostanze patologiche, compreso i disordini autoimmuni e cancro1,2,3. In assenza di uno stimolo, l’attività di NF-κB sono tenute inibita di IκB (inibitore di-f-κB) proteine4. La fosforilazione di specifici residui di Ser IκB proteine marchia per ubiquitinazione e degradazione proteasomica successive o elaborazione selettiva5. Due altamente omologo Ser/Thr chinasi, IKK2/β e IKK1/α, agiscono come regolatori centrale delle attività di NF-κB effettuando questi eventi di fosforilazione6,7.
Interazioni tra un ligando e un recettore trasduce un segnale attraverso una serie di mediatori che portano all’attivazione di fattori di n-f-κB. Il processo di segnalazione di NF-κB possa essere classificato in due percorsi distinti – canoniche e non canoniche (alternativi)8. L’attività di IKK2/β regola principalmente la segnalazione di n-f-κB del pathway canonico che è essenziale per le risposte immunitarie infiammatorie e innata9. Una caratteristica distintiva di questa via è un’attivazione rapida e di breve durata di IKK2/β10 all’interno di un complesso di IKK finora biochimicamente atipici — presunto per essere composto di IKK1 e IKK2, nonché un componente regolamentazione, NEMO (n-f-κB modulatore essenziale )11,12,13. Tra le due subunità catalitiche IKK del complesso IKK, IKK2 è principalmente responsabile14 per la fosforilazione di specifici residui di prototipo IκBs (α, – β e γ-) associati a NF-κB e anche una proteina IκB atipica, NF-κB1/p105, che è un precursore della subunità p50 NF-κB5. Fosforilazione indotta ubiquitinazione e degradazione proteasomal di IκB (o elaborazione di p105) conduce al rilascio e attivazione di un set specifico di n-f-κB dimeri15. Attività di NF-κB aberrante a causa di cattiva regolazione funzione di IKK2 è stato osservato in molti cancri pure come in disordini autoimmuni2,3,16.
In contrasto con IKK2/β, attività di IKK1/α regola NF-κB segnalazione della via non canonica, che è essenziale per lo sviluppo e l’immunità. IKK1 fosforila residui specifici di NF-κB2/p100 sul relativo segmento C-terminale IκBδ, che conduce alla sua elaborazione e la generazione di p52. La formazione dell’eterodimero p52:RelB trascrizionalmente attiva inizia una risposta lenta e sostenuta a segnali dello sviluppo7,17,18,19,20. Interessante, la generazione del centrale p52 fattore NF-κB di questa via è criticamente dipendente da un altro fattore, n-f-κB inducendo chinasi (NIK)21,,22, ma non sul IKK2 o NEMO. Nelle cellule a riposo, il livello di NIK rimane basso a causa della sua costante degradazione proteasoma-dipendente23,24,25. Stimolazione delle cellule da ligandi ‘non canoniche’ e in alcune cellule maligne, NIK diventa stabilizzato per reclutare e attivare IKK1 / α. le attività della chinasi di NIK e di IKK1 sono essenziali per un’elaborazione efficiente di p100 in p527. IKK1 e NIK fosforilare tre serine (Ser866, 870 e 872), NF-κB2/P100 sul relativo segmento IκBδ C-terminale che porta l’elaborazione e la generazione di p52. Attivazione aberrante del pathway non canonico è stato implicato in molte malignità compreso il mieloma multiplo26,27,28.
Diversi inibitori altamente efficienti e specifici per IKK2/β sono noti, anche se nessuno finora si sono rivelati essere un farmaco efficace. Al contrario, gli inibitori IKK1/α-specific sono sparsi. Questo può derivare in parte dalla nostra mancanza di informazione strutturale e biochimica su IKK1/α, che limita la nostra comprensione della base meccanicistica dell’attivazione di NF-κB di IKK1 nelle cellule e progettazione razionale dei farmaci. Le strutture dei raggi x di IKK2/β ci ha fornito con intuizioni il meccanismo di attivazione di IKK2/β29; Tuttavia, queste strutture non ha potevano rivelare come i diversi stimoli a Monte innescare l’attivazione di IKK1/α o β/IKK2 regolare insiemi distinti di n-f-κB attività 30,31. Per capire la base meccanicistica sottostante la funzione di segnalazione distinta di IKK1/α e a istituire una piattaforma per la progettazione razionale dei farmaci, ci siamo concentrati sulla determinazione della struttura di IKK1/α.
Soluzione di produzione, la cristallizzazione e la struttura delle due proteine IKK relative
Abbiamo precisato per determinare la struttura di cristallo dei raggi x di IKK1/α con la nozione che sarebbe stato un esercizio relativamente semplice, dato la nostra esperienza con la produzione della proteina IKK2/β, cristallizzazione e determinazione della struttura. Tuttavia, siamo rimasti molto sorpresi che queste due proteine correlate si comportavano in modo molto diverso per quanto riguarda la facili…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il personale presso il beamlines 19ID, 24ID e 13ID alla Advanced Photon fonte, Lemont, IL, per il supporto durante la raccolta di dati su vari cristalli. Siamo grati a Dmitry Lyumkis, Istituto di Salk per noi il recupero la mappa di cryo-EM bassa risoluzione alle fasi iniziali di EM mappa/modello edificio, che è stato usato per costruire il modello di ricerca molecolare sostituzione IKK1 iniziale. La ricerca che porta a questi risultati ha ricevuto finanziamenti da sovvenzioni NIH AI064326, CA141722 e GM071862 a GG. SP è attualmente un Wellcome Trust DBT India intermedio Fellow.
Cellfectin/Cellfectin II | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II |
Sf900 III Insect cell medium | Thermo Fisher Scientific | 12658-027 | |
SF9 cells | Thermo Fisher Scientific | 12659017 | |
anti-IKK1 antibody | Novus Biologicals | NB100-56704 | Previously sold by Imgenex |
anti-PentaHis antibody | Qiagen | 34460 | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Nitrocellulose can also be used |
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
Bradford assay reagent | BioRad | 500001 | |
Superdex 200 column | GE Healthcare | 28989335 | |
Amicon concentrator | Millipore | UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024 | |
Compound A | Bayer | ||
Calbiochem IKK-inhibitor XII | Calbiochem | 401491 | |
Staurosporine | SIGMA | S4400 | |
MLN120B | Millenium | Gift item | |
AMPPNP | SIGMA | A2647 | |
Dextran sulfate | SIGMA | 51227, 42867, 31404, | |
Dextran sulfate | Alfa Aesar | J62101 | |
PEG | SIGMA | 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 | Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #. |
Crystallization Screens | |||
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) | Hampton Research | HR2-130 | |
Index HT | Hampton Research | HR2-134 | |
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) | Hampton Research | HR2-139 | |
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) | Hampton Research | HR2-086 | |
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) | Hampton Research | HR2-136 | |
Crystal mounts | Hampton Research | HR8-188, 190, 192, 194 | |
Synchrotron | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory | Beamline 19 ID | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines. |