Stereological raming van de Dopaminerge Neuron nummer in de muis Substantia Nigra met behulp van de optische Fractionator en standaard microscopie apparatuur
Summary
Dit werk presenteert een stapsgewijze protocol voor de onbevooroordeelde stereological schatting van Dopaminerge neuronale cel nummers in de muis substantia nigra met behulp van standaard microscopie apparatuur (dat wil zeggen, een lichte Microscoop, een tabel van de gemotoriseerde object (x, y, z vliegtuig), en publiek domein-software voor digitale beeldanalyse.
Abstract
In pre-klinische van Parkinson onderzoek is analyse van het nigrostriatal-darmkanaal, met inbegrip van de kwantificering van de Dopaminerge neuron verlies in de substantia nigra, essentieel. Voor het inschatten van de totale Dopaminerge neuron nummer, onbevooroordeelde stereology met behulp van de optische fractionator-methode wordt momenteel beschouwd als de gouden standaard. Omdat de theorie achter de optische fractionator methode complex is en stereology moeilijk is te bereiken zonder gespecialiseerde apparatuur, bestaan verschillende verkrijgbare volledige stereology systemen die de benodigde software bevatten, zuiver tellen de redenen voor de cel. Sinds de aankoop van een gespecialiseerde stereology setup is niet altijd haalbaar is, om vele redenen, dit verslag wordt een methode beschreven voor de stereological schatting van Dopaminerge neuronale cel met behulp van standaard microscopie apparatuur telt, met inbegrip van een lichte Microscoop, een gemotoriseerd tabel object (x, y, z vliegtuig) met beeldbewerkingssoftware, en een computer voor analyse. Een stapsgewijze uitleg wordt gegeven over het uitvoeren van stereological kwantificering met behulp van de methode van de optische fractionator en voorgeprogrammeerde bestanden voor de berekening van de geschatte cellen worden geleverd. Om te beoordelen van de juistheid van deze methode, werd een vergelijking met gegevens die zijn verkregen uit een commercieel verkrijgbare stereology apparaat uitgevoerd. Vergelijkbare cel nummers werden gevonden met behulp van dit protocol en de stereology apparaat, dus het aantonen van de precisie van dit protocol voor onbevooroordeelde stereology.
Introduction
De kwantificering van de neuronale cel nummer is cruciaal in de pre-klinische van Parkinson onderzoek om te bepalen van het niveau van neurodegeneratie binnen de substantia nigra (SN)1,2. De onbevooroordeelde stereological schatting van het aantal cellen in een gebied van belang wordt beschouwd als de gouden standaard3,4,5.
Vóór de komst van onpartijdige stereology, was het aantal neuronen in secties beoordeeld door het manipuleren van de getelde cel profielen om te corrigeren voor de variabele waarschijnlijkheid dat neuronen in zicht in een sectie komen. Een van de meest gebruikte methoden was de correctie van de graven van de gekwantificeerde cel beschreven door Abercrombie6. Deze methode geprobeerd rekening dat cellen meer dan één keer kunnen worden gekwantificeerd, als fragmenten van dezelfde cel in aangrenzende dunne secties worden gevonden. Daarom, Abercrombie en andere auteurs gegenereerd vergelijkingen die veronderstellingen over de vorm, grootte en oriëntatie van de getelde cellen7,8 vereist. Deze aannames waren echter meestal niet gerealiseerd en dus geleid tot systematische fouten en divergentie van de werkelijke celaantal (dat wil zeggen, bias). Bovendien kon de bias niet verlaagd worden door aanvullende monsters3.
Voor de stereological schatting van cel nummers met behulp van de optische fractionator, worden wiskundige beginselen toegepast om direct de cel nummers direct in een gedefinieerde, 3-dimensionale volume schatten. Het voordeel van deze methode is dat het geen veronderstellingen over de vorm, grootte en oriëntatie van de cellen wordt geteld. Dus de geschatte cel nummers zijn dichter bij de werkelijke waarden en dichter als de grootte van de steekproef (dat wil zeggen, onbevooroordeelde)3 toeneemt. Omdat vele regels moeten worden gevolgd bij het gebruik van stereology om te houden van de methode onbevooroordeelde, kant-en-klare commerciële stereology systemen zijn ontwikkeld (Zie voor herziening, Schmitz en Hof, 20054). Gespecialiseerde stereology systemen implementeren ontwerp gebaseerde stereological methoden met een vooraf gedefinieerd sondes en bemonsteringsplannen voor stereological evaluaties die tot onafhankelijkheid van vorm, grootte, ruimtelijke verdeling en oriëntatie van leiden de cellen die moeten worden geanalyseerd4,9. Echter zijn commercieel verkrijgbare stereology systemen duur; deze kan uitvoering in nieuw onderzoek beperken.
Het doel van deze studie was het ontwikkelen van een bruikbare techniek voor de ontwerp-gebaseerd stereological schatting van Dopaminerge cel graven in de muis SN, dienst van de optische fractionator methode en met behulp van standaard microscopie apparatuur (dat wil zeggen, licht Microscoop, standaard Microscoop software en een gemotoriseerde x, y, z toneel). Hiervoor is een geleidelijke gids op hoe verwerken muis hersenweefsel en hoe te schatten SN cel nummers met behulp van ontwerp gebaseerde onbevooroordeelde stereology gepresenteerd. Bovendien worden de sjablonen voor de berekening van de geschatte cel nummers en coëfficiënten van fout (CE) geleverd.
De hier beschreven methode is niet beperkt tot de analyse van de SN, maar kan worden aangepast voor gebruik in andere anatomisch gedefinieerde regio’s van de muis of rat hersenen. Bijvoorbeeld, is onbevooroordeelde stereology gebruikt voor het schatten van de neuronale cel nummers in de hippocampus10 en de locus coeruleus11. Celtypes dan neuronen, zoals astrocyten12 en microglia13, kunnen daarnaast ook worden beoordeeld. Deze methode kan dus nuttig aan wetenschappers die willen implementeren onbevooroordeelde stereology in hun onderzoek, maar zijn niet bereid om te besteden een heleboel geld voor de aankoop van een stereology systeem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereology begint met de verwerking van het weefsel. De seriële snijden van SN weefsel moet zorgvuldig worden uitgevoerd om te voorkomen dat het verlies van secties tijdens de stereological analyse. Daarnaast is een essentiële stap ter gelegenheid van een halfrond teneinde te onderscheiden van het recht van de links SN bij het uitvoeren van stereology. Plaatsen van een klein gaatje in het bovenste deel van de hersenstam gegenereerd de beste resultaten in de gepresenteerde studie. Bovendien, sinds het werken met de opti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn Keali Röhm, Louisa Frieß en Heike Menzel erkentelijk voor hun deskundige technische bijstand; aan Helga Brünner voor de verzorging van de dieren; en Chistopher S. Ward voor de productie- en distributieactiviteiten van de optische disector raster plugin voor de ImageJ software.
Materials
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson’s disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).
- Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson’s disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
- Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316 (2011).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
- Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
- Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
- Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
- Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).
- Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
- Paxinos, G., Franklin, K. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- . Grid_Overlay.java Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010)
- . cell_counter.jar Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010)
- Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).
- Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
- German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
- Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).
