Optik Fractionator ve standart mikroskobu ekipmanlar kullanarak fare gözlemliyorum Nigra dopaminerjik nöron sayısının stereological tahmin
Summary
Bu eser dopaminerjik nöron hücre sayıları tarafsız stereological tahmini için adım adım bir protokol fare gözlemliyorum standart mikroskobu kullanýlýyor (Yani, bir ışık mikroskobu, bir motorlu nesne tablo (x, y, z nigra içinde sunar. uçak) ve kamuya açık yazılım dijital görüntü analizi için.
Abstract
Önceden klinik Parkinson hastalığı araştırma, analiz miktar gözlemliyorum nigra içinde dopaminerjik nöron kaybı da dahil olmak üzere nigrostriatal sistemi esastır. Toplam dopaminerjik nöron sayısı tahmin etmek için tarafsız stereology optik fractionator yöntemini kullanarak şu anda altın standart olarak kabul edilir. Optik fractionator yöntemi arkasındaki teori karmaşık olduğu için ve stereology özel ekipman elde etmek zor olduğu için gerekli yazılımı dahil birkaç ticari olarak mevcut tam stereology sistemleri, tamamen var hücre için nedenleri sayma. Özel stereology Kur satın alma her zaman birçok nedenden dolayı mümkün olmadığına göre bir ışık mikroskobu, dahil olmak üzere standart mikroskobu kullanýlýyor dopaminerjik nöron hücre stereological tahmini sayar için bu raporu bir yöntem açıklanır bir nesne tablosu (x, y, z uçak) görüntüleme yazılımı ve analiz için bir bilgisayar ile motorlu. Adım adım açıklama stereological miktar optik fractionator yöntemini kullanarak gerçekleştirme konusunda verilir ve önceden programlanmış dosyaları tahmini hücre sayımları hesaplanması için sağlanır. Bu yöntem doğruluğunu değerlendirmek için piyasada bulunan stereology cihaz elde edilen verilere bir karşılaştırma gerçekleştirildi. Benzer hücre sayıları bu protokol ve stereology aygıt kullanarak böylece tarafsız stereology için bu protokolü duyarlık gösteren bulundu.
Introduction
Miktar nöronal hücre sayının gözlemliyorum nigra (SN)1,2içinde ateş düzeyini belirlemek için önceden klinik Parkinson hastalığı araştırma çok önemli. Bölge hücre sayısı faiz tarafsız stereological tahmini altın standart3,4,5olarak kabul edilir.
Tarafsız stereology gelişiyle önce nöronlar gelmek içine bir bölümü görünürde değişken olasılıklar için düzeltmek için sınırlı sayıda hücre profilleri manipüle ederek bölümleri nöronların sayısı değerlendirildi. En sık kullanılan yöntemlerden birini quantified hücre sayımları Abercrombie6tarafından açıklanan düzeltme yapıldı. Bu yöntem aynı hücreyi parçaları bitişik ince bölümlerde bulunursa, hücreler birden çok kez sayılabilir dikkate almaya çalıştı. Bu nedenle, Abercrombie ve diğer yazarlar şekli, boyutu ve yönlendirmesi sayılan hücreleri7,8hakkında varsayımlar gerekli denklemler oluşturulan. Ancak, bu varsayımlar genellikle değil fark etti ve bu nedenle gerçek hücre sayısı (Yani, önyargı) sistematik hatalar ve ıraksak evrim süreçleri sonucu yol açtı. Ayrıca, önyargı ek örnekleme3tarafından azaltılabilir değil.
Optik fractionator kullanarak hücre sayıları stereological tahmini için doğrudan doğrudan birimindeki bir tanımlanmış, 3 boyutlu hücre sayıları tahmin etmek için matematik ilkeleri uygulanır. Bu yöntemin avantajı şekli, boyutu ve yönlendirmesi sayılır varlık hücre hakkında varsayımlar anlamına gelmez mi. Böylece, tahmini hücre sayıları için gerçek değerleri daha yakın olan ve örnek boyutu (Yani, tarafsız)3arttıkça daha yakın olsun. Birçok kural stereology yöntemi tarafsız tutmak için kullanılırken izlenmesi gerekir çünkü, kullanıma hazır ticari stereology sistemleri geliştirilmiştir (gözden geçirme için bkz: Schmitz ve Hof, 20054). Özel stereology sistemlerinin uygulanması Tasarım temelli stereological yöntemleri ile tanımlanan bir priori sonda ve örnekleme düzenleri şekil, boyut, kayma dağıtım ve yönlendirmesi’dan bağımsızlığını yol stereological değerlendirmeler için hücreleri analiz4,9olmak. Ancak, piyasada bulunan stereology sistemleri pahalıdır; Bu yeni araştırma uygulamasında sınırlayabilir.
Bu çalışmada dopaminerjik hücre sayıları Mouse optik fractionator yöntemle contalı profillerde hem standart mikroskobu donanımları (Yani, ışık kullanarak SN, Tasarım temelli stereological tahmini için kullanışlı bir teknik geliştirmekti mikroskop, standart mikroskop bilgisayar yazılımı ve motorlu bir x, y, z sahne). Bunun için fare beyin dokusunu işlemek ve tarafsız stereology tasarım tabanlı kullanarak SN hücre sayıları tahmin hakkında adım adım yönergeler sunulmaktadır. Ayrıca, tahmini hücre sayıları hesaplama ve katsayıları hata (CE) için şablonlar sağlanır.
Burada açıklanan yöntemi SN analiz için sınırlı değildir, ancak fare ya da sıçan beyin anatomik olarak tanımlanmış diğer bölgelerinde kullanmak için adapte edilebilir. Örneğin, tarafsız stereology nöronal hücre sayıları Hipokampus10 ve11locus coeruleus tahmin etmek için kullanılan. Buna ek olarak, nöronlar, astrocytes1312 ve microglia gibi farklı hücre tipleri de değerlendirilebilir. Bu nedenle, bu yöntem tarafsız stereology onların araştırma uygulamayı istediğiniz ama çok stereology sistem satın almak için para harcamaya istekli olmayan bilim adamları için yararlı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereology doku işleme ile başlar. Seri kesim SN doku stereological Çözümleme sırasında bölümler kaybını önlemek için dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir. Ayrıca, sağ sol SN stereology gerçekleştirirken ayırmak için bir Yarımküre işaretlemek için bir temel adım olduğunu. Beyin sapı üst kısmında küçük bir delik yerleştirerek en iyi sonuçları sunulan çalışmada oluşturulan. Ayrıca, immünhistokimya, antikor ve diğer kuluçka sıvı doku penetrasyon sırasında daha yay…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, uzman teknik yardım Keali Röhm, Louisa Frieß ve Heike Menzel için minnettarız; Helga Brünner hayvan bakımı için için; ve Chistopher S. Ward için üretim ve dağıtım ImageJ yazılım için optik disector kılavuz eklentisi için.
Materials
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson’s disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).
- Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson’s disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
- Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316 (2011).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
- Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
- Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
- Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
- Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).
- Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
- Paxinos, G., Franklin, K. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- . Grid_Overlay.java Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010)
- . cell_counter.jar Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010)
- Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).
- Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
- German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
- Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).
