Summary
Door een dubbele behandeling met colchicine kan een plantaardige toxine die delende cellen doodt, zenuwvrije Hydra vulgaris gegenereerd worden. Deze Hydra kunnen niet op zichzelf voeden of opkomen. Dit artikel beschrijft een verbeterde methode voor langdurig onderhoud van zenuwvrije Hydra vulgaris in het laboratorium.
Abstract
De interstitiële cellijn van Hydra omvat multipotente stamcellen, en hun derivaten: kliercellen, nematocyten, kiemcellen en zenuwcellen. De interstitiële cellen kunnen worden geëlimineerd door twee opeenvolgende behandelingen met colchicine, een plantaardig afgeleid toxine dat delende cellen doodt, waardoor het potentieel voor vernieuwing van de gedifferentieerde cellen die afgeleid zijn van de interstitiale stamcellen wissen. Dit zorgt voor de generatie van Hydra die zenuwcellen ontbreekt. Een zenuwvrije poliep kan zijn mond niet openen om osmotische druk te voeden, te bevestigen of te reguleren. Dergelijke dieren kunnen echter overleven en onbeperkt in het laboratorium worden gekweekt als ze regelmatig worden gevoed en geborsteld. Het gebrek aan zenuwcellen zorgt voor studies van de rol van het zenuwstelsel bij het reguleren van diergedrag en regeneratie. Voorheen gepubliceerde protocollen voor zenuwvrij Hydra onderhoud behoren verouderde technieken zoals mondpipetten met handgetrokken micropipette tIps om de Hydra te voeden en te reinigen. Hier wordt een verbeterd protocol voor het onderhoud van zenuwvrije Hydra geïntroduceerd. Met fijngespoten tangen worden de mond opengemaakt en vers gedood Artemia . Na de krachtvoeding wordt de lichaamsholte van het dier gespoeld met vers medium met behulp van een spuit en een inktnek om ongeversteld materiaal te verwijderen, hierna aangeduid als "boren". Deze nieuwe methode van krachtvoeding en borstende zenuwvrije Hydra door het gebruik van tang en spuiten elimineert de behoefte aan mondpipettering met handgetrokken micropipette tips. Het maakt het proces dus veiliger en aanzienlijk meer tijd efficiënt. Om ervoor te zorgen dat de zenuwcellen in het hypostome zijn geëlimineerd, wordt immunohistochemie gebruikt met anti-tyrosine-tubuline.
Introduction
Het zenuwstelsel van Hydra bestaat uit een zenuwnet, met neuronen geassocieerd met beide epitheliale weefsellagen 1 . Het zenuwnet is dikker in de hypostome en de peduncle en minder dicht in de lichaamskolom 2 . De zenuwcellen zijn afkomstig van interstitiële stamcellen, die multipotente stamcellen zijn die aanleiding geven tot secretory cellen, nematocyten, kiemcellen en neuronen 1 . Het is mogelijk om de interstitiële cellen van Hydra vulgaris te elimineren door middel van behandeling met colchicine 3 , 4 , een plantaardig afgeleid toxine dat delende cellen doodt. Hoewel colchicine gevonden is om microtubulepolymerisatie in andere organismen te remmen, heeft een eerder onderzoek aangetoond dat microtubules aanwezig zijn in Hydra gedurende de gehele behandeling, wat suggereert dat colchicine op deze manier niet in Hydra 3 optreedt. Een andere stUty suggereert dat colchicine niet efficiënt bindt aan tubuline in sommige organismen, waaronder Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas en Schizosaccharomyces pombe, die dit verschil kunnen verklaren 5 . De colchicinebehandeling induceert fagocytose van de interstitiële cellen door de endodermale epitheelcellen 3 en maakt derhalve het mogelijk creatie van dieren die zenuwcellen, kliercellen en nematocyten ontbreken. Het is onduidelijk waarom de interstitiële cellen bijzonder vatbaar zijn voor colchicinebehandeling. Gezien het feit dat zowel postmittotische interstitiële cellen als de interstitiale stamcelstammen beschadigd en fagocytose zijn, concludeerde Campbell dat colchicine geen directe invloed heeft op de mitotische activiteit 3 . In het bijzonder werkt de colchicine behandeling goed in Hydra vulgaris, maar is aangetoond dat het ook niet werkt bij andere soorten, zoals Hydra oligactis 6 . Hydra viridis 7 te produceren. Zenuwvrije Hydra (ook soms aangeduid als "epithelial Hydra " 8 ) zijn daarom een nuttig hulpmiddel om de rollen van deze gespecialiseerde celsoorten uit de interstitiale cellijn in de homeostase van weefsels en regeneratie te bestuderen.
Hydra kan het enige bekende voorbeeld zijn van een dier dat in staat is om zonder een zenuwstelsel te leven. Zenuwvrije Hydra dienen als een bijzonder nuttig model voor het dissecteren van de rol van het zenuwnet bij het regelen van hydra regeneratie, homeostase en gedrag. Bijvoorbeeld, de introductie van interstitiële cellen in zenuwvrije Hydra via transplantatie liet de karakterisering van zenuwceldifferentiatie toe als zeer regio-specifiek 9 . Bovendien, omdat zenuwvrije Hydra kan regenereren, zijHet onderzoek mogelijk maken van alternatieve, zenuwstelsel onafhankelijke regeneratie pathways. Een dergelijk voorbeeld is apische neurogenese en hoofdvorming , die blijkt te zijn afhankelijk van de cnox-2 functie in het zenuwstelsel in wildtype Hydra , maar lijkt onmogelijk te zijn in zenuwvrije Hydra , wat suggereert dat er een alternatief hoofdregeneratieproces kan zijn 10 .
Zenuwvrije Hydra zijn ook gebruikt om epitheliale celuitdrukking en regulatie van neurogene en neurotransmissiegenen na het verlies van neurogenese 11 te bestuderen. Zenuwvrije Hydra vertoont geen spontane samentrekkingen 12 , wat aangeeft dat deze barsten door het zenuwstelsel gereguleerd worden. Zenuwvrije Hydra treedt echter overeen als reactie op het klemmen van de lichaamskolom met pincet, wat suggereert dat samentrekking in reactie op mechanische stimuli gemedieerd wordt door koppeling throuGh gap junctions in epitheelcellen, terwijl spontane contractiele gedrag wordt gemedieerd door koppeling door middel van gapingen in zenuwcellen 13 .
Zenuwvrije Hydra openen hun mond niet wanneer ze worden aangeboden met voedsel of gereduceerd glutathion 3 , wat suggereert dat sensorische neuronen nodig zijn om de aanwezigheid van voedsel op te sporen en de mond te openen om te openen. Bovendien lijkt het zenuwnetje een rol te spelen bij het detecteren van osmotische druk, omdat zenuwvrije dieren hun inwendige hydrostatische druk niet automatisch kunnen reguleren door mondopening, waardoor hun karakteristieke ballonachtige uitstraling 3 , 4 ( Figuur 1B ) wordt veroorzaakt. Regeling van de hydrostatische druk in zenuwvrije Hydra door frequente manuele deflatie leidde tot verlies van enige abnormale morfologie in de hypostoom en lichaamskolom. Chronische deflatie leidde echter tot inmenging met de groei, elOngelijkheid, ontluikende en weefselorganisatie 8 .
Hoewel zenuwvrije Hydra niet in staat zijn zich te voeden en op zichzelf te voeden, is het mogelijk om ze onbepaald in het laboratorium te handhaven door elk dier handmatig te voeden en te begraven. Vorige publicaties hebben methoden beschreven voor krachtvoeding en borstende zenuwvrije Hydra , maar deze protocollen hebben betrekking op het gebruik van micropipette tips die handig moeten worden getrokken, naar de juiste grootte, evenals het gebruik van een mondstuk dat via de buis 14 is verbonden met de pipet. Hier wordt een eenvoudiger, veiliger en meer tijd-efficiënte methode om te voeden en te boren beschreven.
Daarnaast betroffen vroegere studies de afwezigheid van zenuwcellen door dissociatie van vaste dieren in individuele cellen en onderzoek van celmorfologie 3 , 4 , 15 . HImmunohistochemie met een monoklonaal antilichaam tegen de getande carboxyterminal van alfa-tubuline werd gebruikt als een gratis methode voor maceratie om te controleren op de uitputting van neuronen in de hypostome 13 , 16 . Vorige studies hebben aangetoond dat neuronen in de peduncle ook kunnen worden visualiseerd met behulp van dit antilichaam 13 , maar deze neuronen evenals die in de lichaamskolom zijn moeilijker te maken. Terwijl immunohistochemie voldoende is om de afwezigheid van zenuwcellen in het hypostome te bevestigen en geen deskundigheid nodig heeft op celtype morfologie, kan het niet worden gebruikt om te controleren of er geen interstitiële stamcellen en de andere derivaten van deze cellen zijn. Dissociatie- en celmorfologie studies zijn strengere en kunnen een kwantitatief overzicht geven van de cijfers van elk celtype die na elke fase van de behandeling overblijven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dubbele Colchicine Behandeling
- Maak een 0,4% colchicine (gewicht / volume) oplossing in Hydra medium 3 , 4 , 17 .
Let op: Colchicine is acuut giftig, fataal bij inslikken, kan genetische afwijkingen veroorzaken en kan oogletsel veroorzaken. Hanteer het poeder in een dampkoker en draag volledige persoonlijke beschermende uitrusting (PPE). - Incubate Hydra vulgaris (AEP stam werd hier gebruikt) die 24 uur in 0,4% colchicine bij een verhouding van 5 Hydra per ml colchicine oplossing in een Petri schotel gedurende 8 uur bij kamertemperatuur in het donker werden uitgehongerd.
Opmerking: 5 Hydra / mL colchicine is een richtlijn om te bepalen hoeveel oplossing te gebruiken om de schotel te vermijden met Hydra . Gebruik hetzelfde volume van de oplossing voor latere reinigingen en oplossingen. - Verwijder de colchicine oplossing en vervangMet schoon Hydra medium zonder colchicine. Was de Hydra 5 keer door middel van een seriële overdracht met een glaspasteurpipet in schoon Hydra- medium voordat u overgaat naar 50 μg / ml rifampicine in Hydra- medium. Houd de Hydra in een 18 ° C incubator.
Opmerking: Voldoende 1.000X rifampicine voorraad (50 mg / ml) in dimethylsulfoxide (DMSO) gedurende 1-2 weken behandeling kan bij 4 ° C worden opgeslagen. De exacte hoeveelheid kan worden bepaald door het totale volume van de oplossing die elke dag wordt gebruikt. Bijvoorbeeld, als er 2 gerechten zijn, die elk 10 ml oplossing bevatten die tweemaal daags moet worden gewijzigd, wordt in totaal 40 ml oplossing in één dag gebruikt, die overeenkomt met 40 μL van 1.000X voorraad per dag of 560 μL Over een periode van twee weken. De voorraad wordt vervolgens bij gebruik 1: 1000 in Hydra- medium verdund.
Let op: DMSO is een brandbare vloeistof die gemakkelijk de huid binnentreedt, waardoor andere opgeloste chemicaliën in het lichaam kunnen komen. HandLe het oplosmiddel in een dampkoker en draag volledige PPE. Opmerking, DMSO bevriest bij 4 ° C - Verander het rifampicine bevattende Hydra- medium tweemaal daags totdat de Hydra de cellen niet uitstoot in het medium, dat over het algemeen 1 week na de behandeling is. Op dit moment kan het medium een keer per dag worden veranderd. In de dagen na de behandeling zal de Hydra hun tentakels volledig verliezen. Vermijd dat de Hydra in contact zijn met elkaar, aangezien zij samen kunnen smelten en resulteren in vreemd gevormde Hydra ( Figuur 2 A ).
- Om contact te voorkomen, vermijd het gerecht in een cirkelvormige beweging. In plaats daarvan roer het gerecht zachtjes in verticale en horizontale richting totdat de Hydra zich uit elkaar heeft. Controleer het gerecht bij het plaatsen van de Hydra in de 18 ° C incubator en pas indien nodig aan.
Opmerking: voor de dagen dat het medium tweemaal wordt gewijzigd, verander het mediumEen keer in de ochtend en weer in de namiddag / avond.
- Om contact te voorkomen, vermijd het gerecht in een cirkelvormige beweging. In plaats daarvan roer het gerecht zachtjes in verticale en horizontale richting totdat de Hydra zich uit elkaar heeft. Controleer het gerecht bij het plaatsen van de Hydra in de 18 ° C incubator en pas indien nodig aan.
- Zodra de tentakels beginnen te vormen, beginnen met krachtvoeding en begrenzen de Hydra 3 tot 4 keer per week (zie secties 2 en 3). Ongeveer 8-9 dagen na colchicine behandeling, zal de Hydra beginnen hun tentakels te laten groeien.
Opmerking: Tentacle hergroei varieert van individuen. Sommigen kunnen langer dan 8 tot 9 dagen duren voordat u tekenen van tentacle groei laat zien. Degenen die hun tentakels niet terugvallen, evenals vreemd gevormd ( Figuur 2 B ) dieren of dieren die te klein zijn om te worden gevoed, moeten verwijderd worden. Deze Hydra zal waarschijnlijk de tweede behandeling waarschijnlijk niet overleven. De Hydra kan ook knoppen. Sommige van de knoppen kunnen echter nog interstitiële cellen hebben en op zichzelf kunnen eten.- Verwijder alle knoppen die zonder hulp kunnen eten en losmaken van het ouderlijke dier. Identificeer deze dieren door live Artemia toe te voegen aan deVoedende schotel en nagaan of de dieren zelf de Artemia opvangen of eten. 1 of 2 Hydra kan ook op zichzelf eten. Deze moeten ook worden weggegooid.
Opmerking: Zenuwvrije Hydra heeft een karakteristieke ballonachtige morfologie, en tentakels die korter en dunner zijn dan normaal (door verlies van nematocyten) en dus gemakkelijk onderscheiden kunnen worden van normaal uitziende dieren ( Figuur 1A, 1B ).
- Verwijder alle knoppen die zonder hulp kunnen eten en losmaken van het ouderlijke dier. Identificeer deze dieren door live Artemia toe te voegen aan deVoedende schotel en nagaan of de dieren zelf de Artemia opvangen of eten. 1 of 2 Hydra kan ook op zichzelf eten. Deze moeten ook worden weggegooid.
- Drie weken na de eerste colchicinebehandeling, herhaal de colchicinebehandeling (stappen 1.1 - 1.5). Een tweede colchicinebehandeling is nodig om de overblijvende interstitiële cellen en zenuwcellen 3 te elimineren.
2. Force-Feeding
- Voeg Artemia cysten toe aan een smalle en lange glazen houder die aan de onderkant kleint. Vul de container met Artemia water (6,72 M NaCl). Vermijd meer1 g cysten per 1 liter water geven voor een hogere luikopbrengst.
- Bedek de bovenkant van de container met parafilm en steek een 10 ml serologische pipet door de parafilm in de houder. Zorg voor beluchting door de buis aan een aquariumluchtpomp te bevestigen en de buis rondom de pipet te monteren. Zorg ervoor dat de pipetstop de bodem van de container bereikt en dat er geen cysten onderaan worden opgelost. De artemia komt na 48 uur uit.
Opmerking: Er zijn veel verschillende manieren om Artemia uit te pakken die net zo goed kunnen werken.
- Bedek de bovenkant van de container met parafilm en steek een 10 ml serologische pipet door de parafilm in de houder. Zorg voor beluchting door de buis aan een aquariumluchtpomp te bevestigen en de buis rondom de pipet te monteren. Zorg ervoor dat de pipetstop de bodem van de container bereikt en dat er geen cysten onderaan worden opgelost. De artemia komt na 48 uur uit.
- Zet de Artemia uit het Artemia- water in een Artemia- netwerk (verkrijgbaar bij aquariumleveranciers) en was ze ongeveer 20 s in DI water voordat ze in een gerecht met Hydra- medium worden geplaatst. De zoutgehalte van Artemia water is te hoog voor Hydra , dus de Artemia moet worden gewassen voordat ze worden gebruikt.
- Onder een dissecterende microscoop,Euthanize de artemia door ze met een paar fijne tangjes te knijpen. Vermijd krassen genoeg om de ingewanden te verdrijven, aangezien dit aan de tang blijft en het voeden moeilijk maakt. Als u het Artemia licht indrukt, voordat u het aan de Hydra voedt, zal het verteringsproces 14 helpen . Plaats de vers gedood Artemia dicht bij de Hydra in het gerecht om snel voeden te vergemakkelijken.
Opmerking: Alle volgende stappen worden gedaan onder een dissectiemicroscoop. - Gebruik een paar tang om de Hydra vast te houden door de peduncle. Ga door met de peduncle tijdens het proces van het voeden van de Hydra . Knip het lichaamskolom met een tweede paar tang om het Hydra- contract te maken.
- Trek bij het middelpunt van de hypostoom (de koepelstructuur aan het mondstuk van het dier) terwijl u de tips van het tweede paar tang vasthoudt. Dit veroorzaakt soms dat de mond open staat. ikF De mond wordt niet geopend door aan te tikken, de mond te punken door de tang in het midden van de hypostoom te plaatsen en dan de druk op de uiteinden van de tang te verlichten. Dit moet de mondopening die door de punctie wordt gemaakt, uitstrekken.
Opmerking: De Hydra kan afblazen en instorten wanneer de mond wordt geopend ( Figuur 2C ). Als dit gebeurt, kan de Artemia nog steeds in de Hydra worden geplaatst. Als het te moeilijk is, ga dan naar de volgende Hydra en kom later later naar de originele Hydra en probeer het opnieuw. De Hydra hebben de neiging om niet zo veel te ontladen tijdens de daaropvolgende mondopeningen. - Haal Artemia snel op met de tang en plaats ze in de maagholte van Hydra . Voeg zoveel artemia in als de maagholte vol is en meer Artemia kan niet worden ingevoegd zonder de Hydra te beschadigen, ongelukBondgenoot die een artemia binnentrekt of de mond niet meer afsluiten. Gemiddeld is dit 5 tot 6 Artemia , maar tot 12 zijn aan de grotere dieren gevoed.
- Als de mond begint te sluiten, strekt u weer open met de tang zoals hierboven beschreven; Er moet echter voorzichtig worden aangezien artemia al in het dier kan beginnen te komen als de mond heropend wordt.
- Als de Hydra te klein is voor een hele Artemia , snijd de Artemia met een scalpel en voed de Hydra kleinere stukken. Als de Artemia niet in de Hydra blijft , kan het nodig zijn om de pincet tegen de Artemia te drukken om het in de Hydra te houden tot de mond dicht komt.
- Overvoer gevoed Hydra met een glazen Pasteur pipette, zorgvuldig om per ongeluk te begraven, op een schotel met verse 50 μg / ml rifampicine in Hydra- medium. Als een Artemia werd verdreven fBreng de Hydra tijdens het overbrengen, plaats het opnieuw in de nieuwe schotel.
Opmerking: Er wordt een glazen pipet gebruikt om de Hydra over te dragen, aangezien er is gebleken dat Hydra minder aan glas kleeft in vergelijking met plastic. De lengte van de pipet maakt niet uit, maar het gebruik van 5 inch pipetten kan wat makkelijker zijn.
3. Burpen
- Borst de Hydra om ongewerkt materiaal op elk moment tussen 8 en 20 uur na het voeden te verwijderen.
- Zand naar beneden van een 30G hypodermische naald met P320 of soortgelijk korrelschuurpapier tot de punt plat is.
Opmerking: een 27G hypodermische naald zou ook werken, maar de kleinere punt van de hogere maat is beter. - Bevestig de naald aan een 1 ml plastic injectiespuit en vul de spuit met verse 50 μg / ml rifampicine in Hydra- medium.
Opmerking: Het boren van een enkele Hydra duurt ongeveer 0,05 ml tot 0,1 ml oplossing. Een 1 ml syriNge is de voorkeur omdat het controleren van de kracht en het volume van de oplossing die uitkomt moeilijker is met een grotere volume spuit. - Onder een dissectiemicroscoop, houd de peduncle van de Hydra met fijne puntpincen en tik in het midden van de hypostoom met de naald. Als de mond niet open komt, zet de tang in de hypostoom en open de mond zoals hierboven beschreven voor het voeden.
Opmerking: Alle volgende stappen worden gedaan onder een dissectiemicroscoop. - Gebruik de spuit om te spoelen, heel zachtjes om te voorkomen dat het gehele dier, de maagholte met de 50 μg / mL rifampicine oplossing wordt weggeblazen totdat alle rommel is verdreven. De naald hoeft niet noodzakelijkerwijs in de Hydra te worden ingebracht als de grootte van de Hydra niet toestaat. De naald kan dicht bij de mondopening worden gehouden en recht naar de mond gericht zijn.
- Met behulp van een glaspasteurpipet, overgebrachte Hydra naar een schotel met vers 5081; g / ml rifampicine in Hydra- medium.
4. Kwaliteitscontrole via immunohistochemie
OPMERKING: Het volgende protocol is aangepast uit protocollen van Shenk, M. A, et al. 18 , en Böttger, 19 . Alle stappen worden gedaan bij kamertemperatuur (RT) tenzij anders vermeld. Een nutator kan worden gebruikt voor de incubatie stappen en kan de kleuringskwaliteit verbeteren. Als de Hydra echter met elkaar verstrengeld raakt, kunnen alle stappen ook uitgevoerd worden zonder.
- Bereid de blokkerende oplossing voor: 10% foetaal runder serum (FBS) en 1% DMSO in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Bewaar deze oplossing bij 4 ° C tot gebruik (stappen 4.6 en 4.11). De oplossing kan 1 tot 2 dagen opgeslagen worden.
Opmerking: Alle oplossingen die in dit protocol worden gebruikt, moeten goed worden verzameld als gevaarlijk afval. - Ontspan Hydra in 200 μL 2% urethaan in Hydra mEdium gedurende 1 minuut in 1,7 ml microcentrifuge buizen. Gebruik 5 Hydra per buis voor elk van de 4 condities: zenuwvrij, onbehandeld, onbehandeld zonder primair antilichaam en onbehandeld zonder secundair antilichaam.
Opmerking: niet langer dan 1 minuut overschrijden. De timing hier is van cruciaal belang, aangezien dieren in slechte conditie zullen zijn na te veel tijd in urethaan. - Verwijder het urethaan en fixeer de Hydra in 200 μl 4% paraformaldehyde (PFA) in Hydra- medium gedurende 15 minuten.
- Was de monsters 3 keer met 1x PBS gedurende 10 minuten elk.
Opmerking: Alles wassen met PBS en PBSTx wordt gedaan met 500 μL oplossing. - Permeabiliseer met 500 μl 0,5% Triton X-100 in PBS gedurende 15 minuten.
- Verwijder de 0,5% Triton X-100 en voeg 500 μL van de blokkeringsoplossing toe. Blok de monsters gedurende minstens 1 uur.
- Verdun het anti-tyrosine-tubuline-antilichaam 1: 200 in blokkerende oplossing.
Opmerking: deze concentratie was deExperimenteel afgesloten. Als het signaal in de bedieningselementen te zwak is, kan de concentratie mogelijk worden verhoogd. Als er nonspecifieke binding is, moet de concentratie mogelijk worden verminderd. Pre-incubatie van het antilichaam kan ook helpen bij het verminderen van niet-specifieke binding. - Verwijder de blokkerende oplossing uit de monsters en voeg 200 μL van het primaire antilichaam toe aan de zenuwvrije Hydra , onbehandelde controles en onbehandelde controles zonder secundaire. Voor de onbehandelde controles zonder primer, voeg alleen 200 μL blokkerende oplossing zonder het antilichaam toe.
- Incubeer de monsters overnacht (> 12 uur) bij 4 ° C.
Opmerking: Alterneer 5 tot 6 uur bij RT. - Verwijder het primaire antilichaam en was de monsters uitgebreid met 0,3% Triton X-100 in 1x PBS (PBSTx).
Opmerking: Sla het primaire antilichaam op en houd deze bij 4 ° C op, omdat het minstens 2 tot 3 keer hergebruikt kan worden. - Verdunde geit anti-muis hP secundair antibOdy 1: 500 in blokkerende oplossing. Voeg 200 μL toe aan de zenuwvrije Hydra , onbehandelde controles en onbehandelde controles zonder primaire. Voor de onbehandelde controles zonder secundair, voeg alleen 200 μL blokkerende oplossing zonder het antilichaam toe.
Opmerking: Alternatief kan een fluorescerend secundair antilichaam worden gebruikt, waarvoor stappen 4.13 - 4.17 niet nodig zijn. Het gebruik van een fluorescerende secundaire tijd bespaart tijd en is over het algemeen voldoende, maar de hP secundaire zorgt voor verhoogde gevoeligheid. De concentratie van secundair werd experimenteel bepaald. Als de signalen in de bedieningselementen te zwak zijn, moet de concentratie mogelijk worden verhoogd. Als er nonspecifieke binding is, moet de concentratie mogelijk worden verminderd. - Incubeer de monsters overnacht bij 4 ° C.
- Verwijder het secundaire antilichaam en wrijf de monsters uitgebreid met PBSTx.
- Bereid 1x PBT: 0,2% runder serumalbumine (gewicht / volume) en 0,05% Tween20 in 1x PBS. Incubeer de sAmplules in 1x PBT gedurende 30 minuten.
- Verwijder de 1x PBT en incubeer de monsters in 1: 1.000 NHS-fluoresceïne en 1: 10.000 H2O2 in 1x PBT gedurende 15 minuten in het donker. Houd vanaf deze stap de monsters in het donker zoveel mogelijk, aangezien het fluorescerende signaal zal afnemen als ze aan licht worden blootgesteld.
Opmerking: NHS-fluoresceïne werd bereid volgens een gedetailleerd FISH protocol van King, RS en Newmark, PA 20 - Was de monsters 3 keer met PBSTx snel, dan 2 keer gedurende 30 minuten.
- Laat de monsters in PBSTx overnacht op 4 ° C om verder te wassen.
- Doe nog een paar wassen met 1x PBSTx. Om celkernen te visualiseren, voer de volgende optionele stappen uit voor DNA-tegenversterking door gebruik te maken van 4 ', 6-diamindino-2-fenylindool, dihydrochloride (DAPI). Anders kunnen de monsters nu worden afgebeeld.
- Verdun 5 mg / ml DAPI-voorraad tot een werkconcentratie van 1: 500 in PBSTx en voeg 200 μL toe aan elke buis. IncuBat de monsters gedurende 30 minuten.
Let op: DAPI is een bekend carcinogeen. Draag volledige PPE. - Verwijder de DAPI en was de monsters 2 tot 3 keer met PBSTx voor afbeeldingen met fluorescentiemicroscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onmiddellijk na de eerste 8 uur colchicine behandeling, overleven alle Hydra . Sommige van deze Hydra hebben alleen nog tentakelstubben ( Figuur 3 A ), terwijl anderen hun tentakels volledig zullen hebben verloren ( Figuur 3 B ). Over de volgende 1 of 2 dagen zullen de tentakels blijven krimpen totdat alle Hydra hun tentakels hebben verloren. Ongeveer 1 week na de behandeling, tonen de Hydra tekenen van tentacle hergroei, met kleine stompachtige tentakels ( Figuur 3 C ) voordat ze hun tentakels volledig regenereren ( Figuur 3 D ). Van de oorspronkelijke Hydra regenereren ongeveer 50-60% hun tentakels tussen 1-2 weken na de behandeling.
Na de sEcond behandeling, is het herstel van de dieren vergelijkbaar met die na de eerste behandeling. Zo worden ongeveer 10% van het oorspronkelijke aantal dieren dat in beide behandelingen is gegaan, hersteld en groeien tot een maat die geschikt is voor experimenten ( Figuur 1 B ). Deze Hydra hebben tentakels die dunner lijken dan die van onbehandelde dieren, hebben een weefsel dat transparanter is en zal opgeblazen zijn doordat ze niet in staat zijn om hun mond te openen om osmotische druk te verlichten ( Figuur 1 A , 1B). Eventuele dieren die niet gevoed worden kunnen over enkele weken overleven, maar onbeschadigde dieren zullen in grootte krimpen en steeds moeilijker voeden.
Hydra die na de tweede behandeling herstellen, kan onbepaald worden gehandhaafd. Deze dieren kunnen knoppen, waardoor de bevolking wordt behouden en groeit. Bovendien kan de bevolking worden gekweektDoor deze dieren te snijden en hen te laten regenereren 4 .
Immunohistochemie bevestigt het verlies van neuronen in de hypostoom na de tweede colchicinebehandeling. Het dichte zenuwnet in de hypostoom kan worden geïllustreerd met behulp van een anti-tyrosine-tubuline antilichaam 13 , 16 en toont verschillende vezels die uitwendig uit de mond en opvallende cellichamen uitstralen ( Figuur 4A ). Deze vezels zijn afwezig in zenuwvrije Hydra die zijn geproduceerd door dubbele behandeling met colchicine ( Figuur 4 B ). Bovendien onthult co-staining met DAPI een verminderd aantal celkernen in de zenuwvrije Hydra in vergelijking met de onbehandelde controles als gevolg van het verlies van cellen van de interstitiale cellijn als gevolg van de colchicinebehandelingen ( Figuur4A, 4B ).
Figuur 1 . Vergelijking van zenuwvrije en onbehandelde Hydra .
(A) Onbehandelde Hydra . (B) Zenuwvrije Hydra 22 dagen na de tweede colchicine behandeling. Let op de gezwollen lichaamskolom en de dunne tentakels in het zenuwvrije dier. Schaalstaven zijn 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 . Voorbeelden van vervormde Hydra .
(A) Twee Hydra (B) een vreemd gevormde hydra (C) Een Hydra die is ontladen nadat de mond geopend is. Schaalstaven zijn 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3 . Representatieve afbeeldingen van Hydra na de eerste 8 uur colchicine behandeling.
(A) Een Hydra met stompe tentakels onmiddellijk na de behandeling. (B) Een Hydra die zijn tentakels direct na de behandeling volledig heeft verloren. (C) Een Hydra die zijn tentakels begint 8 dagen na de behandeling. (D)Een Hydra die zijn tentakels volledig heeft gerukt 13 dagen na de behandeling. Schaalstaven zijn 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4 . Verlies van zenuwcellen in de hypostoom kan worden bevestigd door immunohistochemie.
(A) De hypostoom van een onbehandeld Hydra en (B) hypostoom van een zenuwvrije Hydra ongeveer 2 weken na de tweede colchicinebehandeling, gemarkeerd met (i) anti-tyrosine-tubuline antilichaam en (ii) DAPI. (Iii) de overlay toont. De * geeft de plaats van de mond aan. Maximale z projecties werden gemaakt van spin-disc confocal fluorescentie z stapels genomen met eXposures van 500 ms (GFP) en 15 ms (DAPI). Helderheid en contrast werden aangepast om de zichtbaarheid te verbeteren. Schaalstaven zijn 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hydra interstitiële cellen kunnen worden geëlimineerd via een dubbele colchicine behandeling 3 , 4 . In de dagen na de eerste behandeling is het van cruciaal belang om contact tussen individuele Hydra te vermijden om fusie van Hydra- stukken in vervormde Hydra te vermijden. Ook kunnen dieren die ongeassistreerd zijn na de eerste behandeling verwijderd worden, omdat de tweede colchicinebehandeling wellicht niet voldoende is om de overblijvende interstitiële cellen uit dergelijke dieren te elimineren. Om de overlevingssnelheid van zenuwvrije Hydra na de tweede colchicinebehandeling te maximaliseren, dienen de dieren zo veel Artemia als mogelijk te worden gevoed na herstel van de eerste behandeling, met 1 tot 2 dagen tussen voedingen om te herstellen en te groeien. Elke colchicinebehandeling zorgt ervoor dat de Hydra aanzienlijk kleiner wordt, aangezien de cellen zijn gestandaardiseerd, dus hoe groter de Hydra zijn voorafgaand aan elke behandeling, de bNa de kansen dat de Hydra zal herstellen naar een maat die kan worden gevoed en onderhouden.
Vanwege het lage overlevingspercentage van Hydra na elke behandeling, is het wenselijk om met veel Hydra te beginnen. Er moet echter voorzichtig zijn met de behandeling van te veel Hydra meteen. Dit zorgt ervoor dat voeding na de eerste behandeling moeilijk en extreem tijdrovend is. Dieren die goed na de eerste behandeling zijn gevoed, herstellen naar grotere maten en hebben daarom een hogere overlevingssnelheid na de tweede behandeling. Zo kan het meer productief zijn om minder te beginnen en beter te voeden. In het algemeen is het beginnend bij 50 - 100 dieren beheersbaar voor 1 - 2 personen. Het is ook het beste om te beginnen met de grootste Hydra mogelijk, want deze zullen de twee behandelingen beter overleven.
De methode van krachtvoeding en borstvoeding Hydra die hier zenuwcellen ontbreekt, is veiliger, eenvoudiger en meer tijd-efficiënt dan de methoden beschreven in het verleden 3 , 4 , 14 . Het gebruik van commercieel verkrijgbare tang en spuiten elimineert de noodzaak voor handgetrokken micropipette tips, die tijdrovend en moeilijk te maken zijn. Het gebruik van deze instrumenten vermijdt ook de behoefte aan mondpipetten. Krachtvoeding met behulp van tang kan in eerste instantie moeilijk zijn, maar gezien voldoende tijd en praktijk wordt het heel makkelijk en efficiënt. Men zou eerst krachtvoeding moeten aanoefenen en normale Hydra moeten boren om een gevoel te krijgen voor hoeveel gebruiksvriendelijkheid met de gereedschap en hoe Hydra moet worden gemanipuleerd. Verschillende pincet- en naaldgroottes werden getest om de optimale gereedschappen voor krachtvoeding en boring te vinden.
Het gebruik van antilichamen kleuring zoals hier beschreven is alleen voldoende om te controleren of er zenuwcellen in het hypostome zijn. Om ervoor te zorgen dat alle interstitiële cellen zijn geëlimineerd, kunnen dieren worden gemerkt enDe soorten cellen aanwezig kunnen worden onderzocht 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Dick Campbell (UC Irvine) voor discussies over het oorspronkelijke protocol voor het opwekken en onderhouden van zenuwvrije dieren, mevrouw Rui Wang voor hulp bij het aanpassen van de spuit- en naaldtechniek, en mevrouw Danielle Hagstrom en dr. Rob Steele (UC Irvine) voor opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de RCSA en NSF-subsidie CMMI-1463572.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 mL Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X - 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 mL Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
- Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
- Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
- Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
- Lee, H. -T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
- Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 295-297 (1983).
- Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
- Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
- Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
- Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
- Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
- Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
- Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 287-290 (1983).
- David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
- Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
- Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 29-34 (1983).
- Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
- Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).
