Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Generering og langvarig vedlikehold av nervefri Published: July 7, 2017 doi: 10.3791/56115
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,2
1Division of Biological Sciences, UC San Diego, 2Physics Department, UC San Diego

Summary

Gjennom en dobbel behandling med colchicin, kan et planteavledet toksin som dreper delende celler, genereres nervefri Hydra vulgaris . Disse Hydra kan ikke mate eller egest på egen hånd. Dette dokumentet beskriver en forbedret metode for langvarig vedlikehold av nervefri Hydra vulgaris i laboratoriet.

Abstract

Den interstitiale cellelinjen av Hydra inkluderer multipotente stamceller, og deres derivater: kjertelceller, nematocytter, bakterieceller og nerveceller. Interstitialcellene kan elimineres gjennom to påfølgende behandlinger med kolchicin, et planteavledet toksin som dreper delende celler, og dermed eliminerer potensialet for fornyelse av de differensierte cellene som er avledet fra de interstitielle stamceller. Dette tillater generering av Hydra som mangler nerveceller. En nervefri polyp kan ikke åpne munnen for å mate, egest eller regulere osmotisk trykk. Slike dyr kan imidlertid overleve og bli dyrket på ubestemt tid i laboratoriet dersom de regelmessig blir drevet og burpet. Mangelen på nerveceller gjør det mulig for studier av nervesystemet i regulering av dyrs adferd og regenerering. Tidligere publiserte protokoller for nervefritt Hydra vedlikehold innebærer utdaterte teknikker som munnpipettering med hånddrekket mikropipett tIps å mate og rengjøre Hydra . Her presenteres en forbedret protokoll for vedlikehold av nervefri Hydra . Fine tipped tanger brukes til å tvinge åpne munnen og sette inn nyslått Artemia . Etter kraftmating spyles kroppens hulrom av frisk medium ved hjelp av en sprøyte og en nål for å fjerne ufordelt materiale, her referert til som "burping". Denne nye metoden for kraftmating og burping nervefri Hydra gjennom bruk av tanger og sprøyter eliminerer behovet for munnpipettering ved hjelp av hånddrevne mikropipettips. Det gjør prosessen sikrere og betydelig mer tidseffektiv. For å sikre at nervecellene i hypostomet er eliminert, gjennomføres immunhistokjemi ved bruk av anti-tyrosin-tubulin.

Introduction

Nervesystemet i Hydra består av et nervenett, med nevroner assosiert med begge epitelvevslag 1 . Nervenettet er tettere i hypostom og peduncle og mindre tett i kropps-kolonnen 2 . Nervecellene stammer fra interstitiale stamceller, som er multipotente stamceller som gir opphav til sekretoriske celler, nematocytter, bakterieceller og neuroner 1 . Det er mulig å eliminere interstitialcellene av Hydra vulgaris ved behandling med kolchicin 3 , 4 , et planteavledet toksin som dreper delende celler. Selv om kolchicin har vist seg å hemme mikrotubulærpolymerisasjon i andre organismer, har en tidligere studie vist at mikrotubuli er tilstede i Hydra gjennom hele behandlingen, noe som tyder på at kolchicin ikke virker på denne måten i Hydra 3 . En annen stUty antyder at colchicin ikke binder effektivt til tubulin i noen organismer, inkludert Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas og Schizosaccharomyces pombe, som kan forklare denne forskjellen 5 . Kolchicinbehandlingen inducerer fagocytose av interstitialcellene av endodermale epitelceller 3 og tillater dermed dannelse av dyr som mangler nerveceller, kjertelceller og nematocytter. Det er uklart hvorfor interstitialceller er spesielt utsatt for kolchicinbehandling. Gitt at både postmittotiske interstitiale celler og interstitial stamcellelinje er skadet og fagocytosed, konkluderte Campbell at colchicin ikke direkte påvirker mitotisk aktivitet 3 . Spesielt virker kolchicinbehandlingen godt i Hydra vulgaris, men har vist seg å ikke fungere også i andre arter, for eksempel Hydra oligactis 6 . Hydra viridis 7 . Nervefri Hydra (også noen ganger referert til som "epithelial Hydra " 8 ) er derfor et nyttig verktøy for å studere rollene til disse spesialiserte celletyper fra interstitialcellelinjen i vevshomostase og regenerering.

Hydra kan være det eneste kjente eksemplet på et dyr som er i stand til å leve uten et nervesystem. Nervefri Hydra fungerer som en spesielt nyttig modell for å dissekere nervenettens rolle ved regulering av hydra regenerering, homeostase og oppførsel. For eksempel tillatt introduksjonen av interstitielle celler i nervefri Hydra via podning for karakterisering av nervecelle-differensiering som svært regionsspesifikke 9 . Videre, fordi nervefri Hydra kan regenerere, deAktivere undersøkelsen av alternative, nervesystem-uavhengige regenereringsveier. Et slikt eksempel er apikal neurogenese og hodedannelse , som har vist seg å være avhengig av cnox-2- funksjonen i nervesystemet i wildtype Hydra , men ser ut til å være dispensable i nervefri Hydra , noe som tyder på at det kan være en alternativ hodregenerasjonsprosess 10 .

Nervefri Hydra har også blitt brukt til å studere epitelcelleuttrykk og regulering av neurogene og nevrotransmissionsgener etter tap av neurogenese 11 . Nervefri Hydra utviser ikke spontane sammentrekningsbarder 12 , noe som indikerer at disse utbruddene er regulert av nervesystemet. Nervefri Hydra kontraherer imidlertid som svar på å klemme kropps-kolonnen med tang, noe som tyder på at sammentrekning som følge av mekaniske stimuli blir formidlet ved å koble throuGh-gapskryss i epitelceller, mens spontan kontraktile atferd er formidlet ved å kople mellom gapskryss i nerveceller 13 .

Nervefri Hydra åpner ikke munnen når de presenteres med mat eller redusert glutation 3 , noe som tyder på at sensoriske nevroner er nødvendige for å oppdage nærvær av mat og signal munnen å åpne. I tillegg synes nervenettet å spille en rolle ved å detektere osmotisk trykk, fordi nervfrie dyr ikke er i stand til å regulere sitt interne hydrostatiske trykk gjennom munnåpning, noe som forårsaker deres karakteristiske ballonglignende utseende 3 , 4 ( figur 1B ). Regulering av hydrostatisk trykk i nervefri Hydra ved hyppig manuell deflasjon førte til tap av noen unormal morfologi i hypostom og kroppssøyle. Men kronisk deflasjon førte til forstyrrelse av vekst, elUlation, spirende og vevsorganisasjon 8 .

Selv om nervefri Hydra ikke er i stand til å mate og egest på egenhånd, er det mulig å opprettholde dem på ubestemt tid i laboratoriet ved å manuelt tvinge og dyrke hvert dyr. Tidligere publikasjoner har beskrevet metoder for kraftmating og burping nervefri Hydra , men disse protokollene innebar bruk av mikropipetttips som må håndtras forsiktig til riktig størrelse, samt bruk av et munnstykke som er koblet til pipetten via rør 14 . Her beskrives en enklere, sikrere og mer tidseffektiv metode for fôring og burping.

I tillegg involverte tidligere studier å undersøke fraværet av nerveceller gjennom dissosiasjon av faste dyr i individuelle celler og undersøkelse av cellemorfologi 3 , 4 , 15 . HEre, immunhistokjemi med et monoklonalt antistoff mot tyrosinerte karboksylterminalen av alfa-tubulin ble anvendt som en komprimeringsmetode for macerering for å sjekke uttømmelsen av nevroner i hypostom 13 , 16 . Tidligere studier har vist at nevroner i peduncle kan også visualiseres ved hjelp av dette antistoffet 13 , men disse nevronene, så vel som de i kropps-kolonnen, er vanskeligere å lage. Selv om immunhistokjemi er tilstrekkelig til å bekrefte fraværet av nerveceller i hypostomet og ikke krever ekspertise på celletypemorfologi, kan den ikke brukes til å kontrollere om fraværet av de interstitielle stamceller og de andre derivatene av disse cellene. Dissociation og cellemorfologi studier er strengere og kan gi en kvantitativ oversikt over tallene for hver celletype som gjenstår etter hvert trinn av behandlingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Dobbelt kolchicinbehandling

  1. Lag en 0,4% kolchicin (vekt / volum) løsning i Hydra medium 3 , 4 , 17 .
    Forsiktig: Colchicin er akutt giftig, dødelig ved svelging, kan forårsake genetiske defekter, og kan forårsake øyeskader. Håndter pulveret i en hette og bruk fullt personlig verneutstyr (PPE).
  2. Incubate Hydra vulgaris (AEP stamme ble brukt her) som har blitt sultet i 24 timer i 0,4% kolchicin i et forhold på 5 Hydra per ml kolchicinoppløsning i en petriskål i 8 timer ved romtemperatur i mørket.
    Merk: 5 Hydra / mL colchicine er en veiledning for å bestemme hvor mye løsning som skal brukes for å unngå overbefolkning av parabolen med Hydra . Bruk det samme volumet av oppløsning for etterfølgende rengjøring og oppløsning.
  3. Fjern kolchicinoppløsningen og erstattMed rent Hydra medium uten kolchicin. Vask Hydra 5 ganger ved seriell overføring med en Pasteur pipette i rent Hydra medium før overføring til 50 μg / mL rifampicin i Hydra medium. Hold Hydra i en 18 ° C inkubator.
    Merk: Tilstrekkelig 1.000X rifampicin lager (50 mg / ml) i dimetylsulfoksid (DMSO) i 1-2 uker behandling kan oppbevares ved 4 ° C. Den nøyaktige mengden kan bestemmes av det totale volumet av løsningen som brukes hver dag. For eksempel, hvis det er 2 retter, som hver inneholder 10 ml løsning som må endres to ganger daglig, vil totalt 40 ml oppløsning bli brukt på en dag, tilsvarende 40 μl 1000 x lager per dag eller 560 μL Over en to ukers periode. Beholdningen fortynnes deretter 1: 1000 i Hydra- medium ved bruk.
    Forsiktig: DMSO er en brennbar væske og trenger lett inn i huden, slik at andre oppløste kjemikalier kommer inn i kroppen. HåndLe løsningsmidlet i en avtrekksdeksel og ha full PPE. Av oppmerksomhet fryser DMSO ved 4 ° C
  4. Bytt det rifampicinholdige Hydra- mediet to ganger daglig til Hydra slutter å utstede celler inn i mediet, som vanligvis er 1 uke etter behandling. På dette tidspunktet kan mediet endres en gang daglig. I løpet av dagene etter behandlingen, vil Hydra helt miste sine tentakler. Unngå å ha Hydra i kontakt med hverandre, da de kan smelte sammen og resultere i merkelig formet Hydra ( Figur 2 A ).
    1. For å hindre kontakt, unngå å svirle oppretten i en sirkelbevegelse. I stedet rør agensen forsiktig i vertikal og horisontal retning til Hydra er spredt fra hverandre. Inspiser fatet ved å plassere Hydra i 18 ° C inkubatoren og juster etter behov.
      Merk: For dagene som mediet endres to ganger, bytt medietEn gang om morgenen og igjen om ettermiddagen / kvelden.
  5. Når tentaklene begynner å danne, begynner kraftmating og burping Hydra 3 til 4 ganger i uka (se avsnitt 2 og 3). Om 8-9 dager etter kolchicinbehandling, vil Hydra begynne å vokse sine tentakler tilbake.
    Merk: Tentacle gjenvekst varierer mellom enkeltpersoner. Noen kan ta lengre tid enn 8-9 dager før de viser tegn på tentakelvekst. De som ikke regrow sine tentakler så vel som merkelig formet ( figur 2 B ) dyr eller dyr som er for små til å bli matet, bør fjernes. Disse Hydra vil trolig ikke overleve den andre behandlingen. Hydra kan også knytte. Noen av knoppene kan imidlertid fortsatt ha interstitiale celler og kunne spise på egenhånd.
    1. Fjern eventuelle knopper som kan spise uten hjelp og løsne fra foreldre dyret. Identifiser disse dyrene ved å legge til levende Artemia tilFôre parabolen og observere om dyrene fanger og spiser artemiaen selv eller ikke. 1 eller 2 Hydra kan også være i stand til å spise på egen hånd. Disse bør også kasseres.
      Merk: Nervefri Hydra har en karakteristisk ballonglignende morfologi, og tentakler som er kortere og tynnere enn normalt (på grunn av tap av nematocytter) og dermed lett kan skille seg fra normalt utseende dyr ( Figur 1 A, 1B ).
  6. Tre uker etter den første kolchicinbehandling, gjenta kolchicinbehandlingen (trinn 1.1 - 1.5). En annen kolchicinbehandling er nødvendig for å eliminere de gjenværende interstitiale celler og nerveceller 3 .

2. Force-Feeding

  1. Legg Artemia- cyster til en smal og høy glassbeholder som klemmer seg på bunnen. Fyll beholderen med Artemia vann (6,72 M NaCl). Unngå å overskrideEdge 1 g cyster per 1 liter vann for et høyere lukeutbytte.
    1. Dekk toppen av beholderen med parafilm og sett inn en 10 ml serologisk pipette gjennom parafilmen i beholderen. Gi lufting ved å feste slangen til en akvariumluftpumpe og montere slangen rundt pipetten. Pass på at pipettespissen når bunnen av beholderen og at det ikke settes ned cyster i bunnen. Artemia vil luke etter 48 timer.
      Merk: Det er mange forskjellige måter å luke Artemia som kan fungere like bra.
  2. Stram Artemia fra Artemia- vannet i et Artemia- nett (tilgjengelig fra akvarietilførselsselskaper) og vask dem i ca 20 s i DI-vann før du plasserer dem i en tallerken med Hydra- medium. Salmen av Artemia vann er for høy for Hydra , så Artemia må vaskes før de blir brukt.
  3. Under et disseksjonsmikroskop,Euthanize artemia ved lett å klemme dem med et par fine tang. Unngå å klemme hardt nok til å utvise tarmene, da dette vil holde fast i tangen og gjøre det vanskelig å fôre. Lette å klemme Artemia før du mate den til Hydra, vil hjelpe til med fordøyelsesprosessen 14 . Plasser den nyoppdagede Artemia nær Hydra i parabolen for å lette rask fôring.
    Merk: Alle påfølgende trinn gjøres under et disseksjonsmikroskop.
  4. Bruk ett par tapper for å holde Hydra ved peduncle. Fortsett å holde peduncle under prosessen med å mate Hydra . Ved hjelp av et annet par tvinge, klemmer du kroppsøylen for å gjøre Hydra- kontrakten.
  5. Mens du holder spissene til det andre paret tang sammen, trykk på midten av hypostomen (den kuppede strukturen ved den orale enden av dyret). Dette fører noen ganger til at munnen åpnes. JegF munnen åpnes ikke ved å tappe, punktere munnen ved å sette tangene inn i midten av hypostomet og deretter slippe trykket på spissene på tangen. Dette bør strekke ut munnåpningen fra punkteringen.
    Merk: Hydra kan deflate og kollapse når munnen er åpnet ( Figur 2 C ). Hvis dette skjer, kan Artemia fortsatt bli satt inn i Hydra . Hvis det er for vanskelig å gjøre det, gå videre til neste Hydra og gå tilbake til den opprinnelige Hydra noen gang senere, og prøv igjen. Hydra har en tendens til ikke å deflate så mye under etterfølgende munnåpninger.
  6. Hent raskt Artemia med tangen og sett dem inn i Hydras magehule. Sett inn så mange Artemia som mulig til magehulen er full og mer Artemia kan ikke settes inn uten å skade Hydra , ulykkenAlliert å trekke ut noen Artemia inne, eller hindre munnen fra å lukke. I gjennomsnitt er dette 5 - 6 Artemia , men opptil 12 er blitt matet til de større dyrene.
    1. Hvis munnen begynner å lukke, strekk den igjen med tangen som beskrevet ovenfor; Det må imidlertid utvises forsiktighet da enhver artemia som allerede er inne i dyret, kan begynne å komme ut når munnen gjenåpnes.
    2. Hvis Hydra er for liten til en hel Artemia , klippe Artemia med en skalpell og mate Hydra mindre biter. Hvis Artemia ikke forblir inne i Hydra , kan det være nødvendig å trykke på tangen mot Artemia for å holde den inne i Hydra til munnen lukkes.
  7. Overfør matet Hydra med et glass Pasteur pipette, forsiktig for å unngå utilsiktet burping, til en tallerken med frisk 50 μg / ml rifampicin i Hydra- medium. Hvis en Artemia ble utvist fRom Hydra mens du overfører, sett det inn igjen mens du er i den nye parabolen.
    Merk: En glasspipett brukes til å overføre Hydra , da det har blitt funnet at Hydra holder seg mindre til glass sammenlignet med plast. Lengden på pipetten spiller ingen rolle, men det kan være litt enklere å bruke 5-tommers pipetter.

3. Burping

  1. Burp Hydra for å fjerne ufordøyd materiale helst mellom 8 og 20 timer etter føding.
  2. Sand ned punktet til en 30G nål med P320 eller lignende sandpapir til spissen er flatt.
    Merk: En 27G hypodermisk nål vil også fungere, men den mindre spissen av den høyere måleren er å foretrekke.
  3. Fest nålen til en 1 ml plastsprøyte og fyll sprøyten med frisk 50 μg / ml rifampicin i Hydra- medium.
    Merk: Burping en enkelt Hydra tar ca 0,05 ml til 0,1 ml løsning. En 1 ml syriNge er å foretrekke siden styring av kraften og volumet av løsningen som kommer ut er vanskeligere med en større volum sprøyte.
  4. Under et disseksjonsmikroskop holder du Pedracle of Hydra med fine punktpinn og trykker i midten av hypostomen med nålen. Hvis munnen ikke åpner, sett inn pinn i hypostomen og åpne munnen som beskrevet ovenfor for fôring.
    Merk: Alle påfølgende trinn gjøres under et disseksjonsmikroskop.
  5. Bruk sprøyten til å spyle, veldig forsiktig for å unngå å blåse hele dyret, magehulen med 50 μg / mL rifampicin løsningen til alle rester har blitt utvist. Nålen trenger ikke nødvendigvis å settes inn i Hydra hvis størrelsen på Hydra ikke tillater det. Nålen kan holdes nær munnåpningen og peker direkte mot munnen.
  6. Bruk en Pasteur pipette, overfør burped Hydra til en tallerken med frisk 5081; g / mL rifampicin i Hydra- medium.

4. Kvalitetskontroll via immunhistokjemi

MERK: Følgende protokoll er tilpasset fra protokoller av Shenk, M. A, et al. 18 , og Böttger, A 19 . Alle trinnene utføres ved romtemperatur (RT) med mindre annet er angitt. En nøtter kan brukes til inkubasjonstrinnene og kan forbedre fargekvaliteten. Men hvis Hydra blir sammenflettet med hverandre, kan alle trinn også utføres uten.

  1. Klargjør blokkeringsløsningen: 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% DMSO i 1x fosfatbuffert saltvann (PBS). Oppbevar denne løsningen ved 4 ° C til bruk (trinn 4.6 og 4.11). Løsningen kan lagres i 1 - 2 dager.
    Merk: Alle løsninger som brukes i denne protokollen må samles inn riktig som farlig avfall.
  2. Slapp av Hydra i 200 μL 2% uretan i Hydra mEdium i 1 min i 1,7 ml mikrocentrifugerør. Bruk 5 Hydra per rør for hver av de 4 tilstandene: nervefri, ubehandlet, ubehandlet uten primær antistoff og ubehandlet uten sekundær antistoff.
    Merk: Ikke overstige 1 min. Tidspunktet her er viktig da dyrene vil være i dårlig form etter å ha brukt for mye tid i uretan.
  3. Fjern uretan og fikser Hydra i 200 μl 4% paraformaldehyd (PFA) i Hydra- medium i 15 minutter.
  4. Vask prøvene 3 ganger med 1x PBS i 10 minutter hver.
    Merk: Alle vasker med PBS og PBSTx gjøres med 500 μL løsning.
  5. Permeabiliseres med 500 μl 0,5% Triton X-100 i PBS i 15 minutter.
  6. Fjern 0,5% Triton X-100 og tilsett 500 μL av blokkeringsløsningen. Blokker prøvene i minst 1 time.
  7. Fortynn anti-tyrosin-tubulin-antistoffet 1: 200 i blokkeringsoppløsning.
    Merk: Denne konsentrasjonen var deAvsluttes eksperimentelt. Hvis signalet i kontrollene viser seg å være for svakt, kan konsentrasjonen kanskje økes. Hvis det ikke er spesifikke bindinger, kan konsentrasjonen bli redusert. Forinkubering av antistoffet kan også bidra til å redusere ikke-spesifikk binding.
  8. Fjern blokkeringsløsningen fra prøvene og tilsett 200 μL av det primære antistoffet til de nervefrie Hydra , ubehandlede kontroller og ubehandlede kontroller uten sekundær. For de ubehandlede kontrollene uten primær, legg bare 200 μL blokkeringsoppløsning uten antistoff.
  9. Inkuber prøvene over natten (> 12 timer) ved 4 ° C.
    Merk: Alternativt inkuberer 5-6 timer ved RT.
  10. Fjern det primære antistoffet og vaske prøvene i stor grad med 0,3% Triton X-100 i 1x PBS (PBSTx).
    Merk: Lag det primære antistoffet og lagre ved 4 ° C, da det kan gjenbrukes minst 2 - 3 ganger.
  11. Fortynn geit-anti-mus hP sekundær antibOdy 1: 500 i blokkering løsning. Tilsett 200 μL til nervefri Hydra , ubehandlede kontroller og ubehandlede kontroller uten primær. For de ubehandlede kontrollene uten sekundær, legg bare 200 μL blokkeringsoppløsning uten antistoff.
    Merk: Alternativt kan et fluorescerende sekundært antistoff brukes, for hvilket trinn 4.13 - 4.17 ikke er nødvendig. Bruke en fluorescerende sekundær sparer tid og er generelt tilstrekkelig, men hP sekundæret gir økt følsomhet. Konsentrasjonen av sekundær ble bestemt eksperimentelt. Hvis signalene i kontrollene viser seg å være for svake, må konsentrasjonen kanskje økes. Hvis det ikke er spesifikke bindinger, kan konsentrasjonen bli redusert.
  12. Inkuber prøvene over natten ved 4 ° C.
  13. Fjern det sekundære antistoffet og vaske prøvene i stor grad med PBSTx.
  14. Forbered 1x PBT: 0,2% bovint serumalbumin (vekt / volum) og 0,05% Tween20 i 1x PBS. Inkubere sAmpler i 1x PBT i 30 minutter.
  15. Fjern 1x PBT og inkuber prøvene i 1: 1000 NHS-fluorescein og 1: 10.000 H2O2 i 1x PBT i 15 minutter i mørket. Fra dette trinnet må du holde prøver i mørket så mye som mulig, da det fluorescerende signalet vil synke da de blir utsatt for lys.
    Merk: NHS-fluorescein ble fremstilt etter en detaljert FISH-protokoll av King, RS og Newmark, PA 20
  16. Vask prøvene 3 ganger med PBSTx raskt, deretter 2 ganger i 30 minutter.
  17. La prøvene i PBSTx over natten ved 4 ° C for å fortsette å vaske.
  18. Vask noen flere med 1x PBSTx. For å visualisere cellekjerner, utfør følgende valgfrie trinn for DNA-motstrekning ved å bruke 4 ', 6-diamindino-2-fenylindol, dihydroklorid (DAPI). Ellers kan prøvene bli avbildet nå.
  19. Fortynn 5 mg / ml DAPI-lager til en arbeidskonsentrasjon på 1: 500 i PBSTx og tilsett 200 μL til hvert rør. IncuBate prøvene i 30 min.
    Forsiktig: DAPI er et kjent kreftfremkallende middel. Bruk full PPE.
  20. Fjern DAPI og vask prøvene 2 - 3 ganger med PBSTx før avbildning med fluorescensmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Umiddelbart etter den første 8 timers kolchicinbehandling, overlever alle Hydra . Noen av disse Hydra vil bare ha tentakle stubber igjen ( Figur 3 A ), mens andre vil ha helt mistet tentaklene ( Figur 3 B ). Over de neste 1 eller 2 dagene vil tentaklene fortsette å krympe til alle Hydra har mistet tentaklene sine. Omtrent 1 uke etter behandlingen, vil Hydra vise tegn på tentakelgenvekst, med små stubbe som tentakler ( Figur 3 C ) før de fullstendig regenererer deres tentakler ( Figur 3 D ). Av den opprinnelige Hydra regenererer rundt 50-60% til slutt sine tentakler mellom 1-2 uker etter behandlingen.

Etter sEcond behandling, er gjenopprettingen av dyrene lik den etter den første behandlingen. Dermed gjenvunnet rundt 10% av det opprinnelige antall dyr som gikk inn i begge behandlingene, og vokste til en størrelse som var egnet for eksperimentering ( Figur 1 B ). Disse Hydra har tentakler som synes tynnere enn de av ubehandlede dyr, har vev som er mer gjennomsiktig og vil oppstå oppblåst på grunn av manglende evne til å åpne munnen for å lette osmotisk trykk ( Figur 1 A , 1B). Eventuelle dyr som ikke er matet, kan overleve i noen uker, men ufedlede dyr vil krympe seg i størrelse og bli stadig vanskeligere å mate.

Hydra som gjenoppretter etter den andre behandlingen kan opprettholdes på ubestemt tid. Disse dyrene kan knytte, og dermed opprettholde og øke befolkningen. I tillegg kan befolkningen bli dyrketVed å kutte disse dyrene og la dem regenerere 4 .

Immunohistokjemi bekrefter tapet av nevroner i hypostomen etter den andre kolchicinbehandling. Det tette nervenettet i hypostomen kan visualiseres ved bruk av et anti-tyrosin-tubulin-antistoff 13 , 16 og viser forskjellige fibre som utstråler utover fra munnen og åpenbare celllegemer ( figur 4A). Disse fibrene er fraværende i nervefri Hydra som er produsert ved dobbeltbehandling med kolchicin ( Figur 4 B ). Videre avslører co-farging med DAPI et redusert antall cellekjerner i det nervefrie Hydra sammenlignet med de ubehandlede kontrollene på grunn av tap av celler i interstitialcellelinjen som et resultat av kolchicinbehandlingene ( Figur4A, 4B ).

Figur 1
Figur 1 . Sammenligning av nervefri og ubehandlet hydra .
(A) Ubehandlet Hydra . (B) Nervefri Hydra 22 dager etter den andre kolchicinbehandlingen. Legg merke til den hovne kroppsøylen og de tynne tentaklene i det frie dyret. Skalestenger er 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2 . Eksempler på deformert hydra .
(A) To Hydra (B) En merkelig formet Hydra . (C) En Hydra som har deflatert etter at munnen er åpnet. Skalestenger er 400 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3 . Representative bilder av Hydra Etter den første 8 timers kolchicinbehandling.
(A) En Hydra med stubby tentakler umiddelbart etter behandling. (B) En Hydra som har mistet sin tentakler helt etter behandling. (C) En Hydra som begynner å regrow sine tentakler 8 dager etter behandlingen. (D)En Hydra som har fullstendig revrovert sine tentakler 13 dager etter behandlingen. Skalestenger er 400 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4 . Tap av nervceller i hypostom kan bekreftes av immunhistokjemi.
(A) Hypostom av et ubehandlet hydra og (B) hypostom av en nervefri Hydra ca. 2 uker etter den andre kolchicinbehandlingen, merket med (i) anti-tyrosin-tubulin antistoff og (ii) DAPI. (Iii) viser overlegget. * Indikerer plasseringen av munnen. Maksimale z-projeksjoner ble laget av spin-disks konfokal fluorescens z stabler tatt med eXposures på 500 ms (GFP) og 15 ms (DAPI). Lysstyrke og kontrast ble justert for å forbedre synligheten. Skalestenger er 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hydra interstitiale celler kan elimineres gjennom en dobbelt kolchicinbehandling 3 , 4 . I dagene etter den første behandlingen er det viktig å forhindre kontakt mellom individuelle Hydra for å unngå fusjon av Hydra- biter i deformert Hydra . Også dyr som kan spise uassistert etter den første behandlingen må fjernes, da den andre kolchicinbehandling ikke kan være tilstrekkelig til å eliminere de gjenværende interstitiale celler fra slike dyr. For å maksimere overlevelsesgraden for nervefri Hydra etter den andre kolchicinbehandlingen, skal dyrene tilføres så mange Artemia som mulig etter gjenoppretting fra den første behandlingen, med 1-2 dager mellom fødselen for å gjenopprette og vokse. Hver kolchicinbehandling fører til at Hydra reduseres betydelig i størrelse ettersom cellene er egested, så jo større Hydra er før hver behandling, bEtter sjansene for at Hydra vil komme seg til en størrelse som kan mates og vedlikeholdes.

På grunn av den lave overlevelsesgraden til Hydra etter hver behandling, kan det være ønskelig å starte med mange Hydra . Det må imidlertid utvises forsiktighet ved å starte behandling på for mange Hydra samtidig. Dette vil gjøre fôring etter den første behandlingen vanskelig og ekstremt tidkrevende. Dyr som mates godt etter første behandling, gjenopprettes til større størrelser og har derfor en høyere overlevelsesrate etter den andre behandlingen. Dermed kan det være mer produktivt å starte med færre og fokusere på fôring bedre. Vanligvis er start med 50-100 dyr håndterbar for 1 - 2 personer. Det er også best å begynne med den største Hydra mulig, da disse bedre vil overleve de to behandlingene.

Metoden for kraftmating og burping Hydra som mangler nerveceller beskrevet her er sikrere, enklere og mer tid-effektive enn metoder beskrevet i siste 3 , 4 , 14 . Bruken av kommersielt tilgjengelige tanger og sprøyter eliminerer behovet for hånddrevne mikropipetttips, som er tidkrevende og vanskelig å gjøre. Bruken av disse verktøyene unngår også behovet for munnpipett. Kraftmatring ved hjelp av tau kan være vanskelig først, men gitt nok tid og praksis, blir det ganske enkelt og effektivt. Man bør først øve kraftmating og burping normal Hydra for å få en følelse av hvor mye kraft som skal brukes med verktøyene og hvordan man skal manipulere Hydra . Forskjellige tang og nålestørrelser ble testet for å finne de optimale verktøyene for kraftmatning og burping.

Bruken av antistofffarging som beskrevet her er bare tilstrekkelig til å kontrollere om fravær av nerveceller i hypostomen. For å sikre at alle interstitiale celler har blitt eliminert, kan dyrene bli macerated ogHvilke typer celler som er tilstede kan undersøkes 15 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Dick Campbell (UC Irvine) for diskusjoner om den opprinnelige protokollen for å generere og vedlikeholde nervefrie dyr, fru Rui Wang for hjelp med å tilpasse sprøyten og nålteknikken, og fru Danielle Hagstrom og Dr. Rob Steele (UC Irvine) for kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av RCSA og NSF-bevilgningen CMMI-1463572.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Colchicine Acros Organics 227120010
1 mL Syringe BD 301025
Brine Shrimp Eggs Brine Shrimp Direct N/A Can be purchased locally
Brine Shrimp Hatchery Dish Brine Shrimp Direct N/A
60 mm x 15 mm Petri Dish Celltreat 229663
30 G x 3/4" Hypodermic Needle Covidien 1188830340 A 27G needle may also be used
2 x Fine-tip Tweezers Dumont 0109-5-PO
Rifampicin EMD Millipore 557303
Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) Enzo ADI-SAB-100-J
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9703-100
Scalpel Fisher 08-920A
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10437028
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306
PBS Tablets MP Bio 2810305
Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine Sigma T9028
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Hydrogen Peroxide Sigma 216763
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148
Triton X - 100 Sigma T9284
Tween 20 Sigma P1379
Urethane Sigma U2500
Air Pump Tetra 77846-00
Glass Pasteur Pipette VWR 53283-916 Length of the pipet does not matter
15 mL Tube VWR 89039-670
P320 Sandpaper 3M IBGABBV00397 Can be purchased at local home improvement store

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
  2. Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
  3. Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
  4. Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
  5. Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
  6. Lee, H. -T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
  7. Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 295-297 (1983).
  8. Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
  9. Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
  10. Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
  11. Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
  12. Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
  13. Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
  14. Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 287-290 (1983).
  15. David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
  16. Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
  17. Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 29-34 (1983).
  18. Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
  19. Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
  20. King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).

Tags

Neurovitenskap utgave 125, Kolchicin fôring nervefrie interstitiale celler immunhistokjemi
Generering og langvarig vedlikehold av nervefri<em&gt; Hydra</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tran, C. M., Fu, S., Rowe, T.,… More

Tran, C. M., Fu, S., Rowe, T., Collins, E. M. S. Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra. J. Vis. Exp. (125), e56115, doi:10.3791/56115 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter