一个简单的神经元机械损伤方法学研究<em>果蝇</em>运动神经元变性
Summary
在这里，我们描述了一种简单且广泛可及的方法来伤害果蝇幼虫的节段性神经，可视化和量化三龄幼虫神经肌肉接头（NMJ）运动神经元的神经变性。
Abstract
神经元的退化发生在正常发育过程中，并且在损伤，压力和疾病的反应中发生。神经元变性的细胞标志在人类和无脊椎动物中是非常相似的，驱动这些过程的分子机制也是如此。 果蝇，果蝇 ，提供了一个强大但简单的遗传模型生物体来研究神经变性疾病的细胞复杂性。事实上，约70％的疾病相关人类基因具有果蝇同系物，并且已经使用苍蝇描述了大量的工具和测定来研究人类神经变性疾病。更具体地说， 果蝇中的神经肌肉接头（NMJ）已经被证明是研究神经肌肉疾病的有效系统，因为能够分析神经元和肌肉之间的结构连接。在这里，我们报告在果蝇的 体内运动神经元损伤测定再次诱导NMJ神经退行24h。使用这种方法，我们描述了导致运动神经元变性的细胞事件的时间序列。损伤方法具有多种应用，并且还被用于鉴定神经变性所需的特定基因并解剖对神经元损伤的转录反应。
Introduction
神经元变性发生在正常发育过程中，可由自然衰老过程，损伤，压力或疾病状态引起。 果蝇黑腹果蝇是常见的果蝇，提供了一个简单而强大的模型生物体来研究神经变性，因为促进神经元退化的分子机制有显着的相似之处。这些相似之处突出表明，大约70％的疾病相关人类基因具有果蝇同系物。 1另外，研究人类神经变性疾病的许多测定和技术工具已被开发并在果蝇中使用 。 2，3在果蝇中 ，神经肌肉接头（NMJ）允许细胞和电生理学特性的分析，并已被证明是研究神经肌肉病的重要系统由于可见Ñeuron肌肉连接。 2在本研究中，我们描述了果蝇幼虫体内神经元损伤测定，其允许节段性神经的可重复损伤。这种运动神经元损伤导致细胞事件的时间序列，导致NMJ损伤后24小时的神经变性。导致神经变性的可重复损伤运动神经元的能力具有多种应用，例如鉴定退行性过程所需的特定基因，对神经元损伤的转录反应的解剖以及保护性信号级联的分析。 4，5，6这方法也被结合使用微流体来研究神经元变性和再生在活的动物。 7
我们利用建立的定量测定来检查运动神经元的退化离子在果蝇 NMJ机械损伤后。该测定是基于突触前膜和蛋白质的丢失先于以突触后肌肉膜折叠为特征的亚突触网（SSR）的拆卸。 8，9，10，11，12，13该试验允许在突触前神经元已经失去了连接到相邻的突触后肌肉“突触足迹”的量化。退化过程已被证明是在幼虫发育12中进行的，并且不能通过改变的突触发育或发芽来解释。 8，9，10，11，12中的广告使用机械损伤超过预先存在的突变的优点是它允许解剖导致NMJ神经变性的细胞事件的时间序列。 13
Protocol
Representative Results
Discussion
早先描述的神经元机械损伤可以用于诱导果蝇幼虫节段神经的损伤/应激。 4，5，6，14本实验技术先前已经被用于剖析事件导致神经变性的时间序列，以及检查在运动神经元细胞体的转录变化后的损伤。 5，14此外，该技术已被用在微流控芯片结合，以…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢奎因皮亚克大学的凯勒和玛吉实验室的所有成员，提供有用的建议。特别是，我们要感谢Barron L. Lincoln II在凯勒实验室内开发这种损伤测定。我们还要感谢Quinnipiac大学艺术与科学学院授予LC Keller的赠款。
Materials
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased/ |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
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