Методология простой нейронной механической травмы для изучения<em> Drosophila</em> Дегенерация моторных нейронов
Summary
Здесь мы описываем простой и широко доступный метод травмирования сегментных нервов у личинок дрозофилы для визуализации и количественной оценки нейродегенерации моторных нейронов в нервно-мышечном соединении (NMJ) личинок третьего возраста.
Abstract
Дегенерация нейронов происходит при нормальном развитии и в ответ на травмы, стресс и болезнь. Клеточные признаки нейрональной дегенерации удивительно похожи у людей и беспозвоночных, а также молекулярные механизмы, которые приводят к этим процессам. Фруктовая мушка Drosophila melanogaster предоставляет мощный, но простой генетический модель организма для изучения клеточных проблем нейродегенеративных заболеваний. Фактически, около 70% связанных с болезнью генов человека имеют гомологи Drosophila, а множество инструментов и анализов описано с использованием мух для изучения нейродегенеративных заболеваний человека. Более конкретно, нейромышечный переход (NMJ) у Drosophila оказался эффективной системой для изучения нейромышечных заболеваний из-за способности анализировать структурные связи между нейроном и мышцей. Здесь мы сообщаем об анализе травматического повреждения нейронов in vivo у Drosophila , которыйВоспроизводимо индуцирует нейродегенерацию в NMJ через 24 часа. Используя эту методологию, мы описали временную последовательность клеточных событий, приводящих к дегенерации моторных нейронов. Метод травматизма имеет разнообразные применения и также используется для идентификации конкретных генов, необходимых для нейродегенерации, и для анализа транскрипционных ответов на повреждение нейронов.
Introduction
Дегенерация нейронов происходит при нормальном развитии и может быть вызвана естественным процессом старения, травмой, стрессом или болезненными состояниями. Drosophila melanogaster , общая плодовая муха, обеспечивает простой и мощный модельный организм для изучения нейродегенерации из-за замечательных сходств в молекулярных механизмах, которые приводят к дегенерации нейронов. Эти сходства подчеркиваются тем фактом, что около 70% связанных с заболеванием человеческих генов имеют гомологи Drosophila . 1 Кроме того, были разработаны и использованы в Drosophila многочисленные анализы и технологические инструменты для изучения нейродегенеративных заболеваний человека. 2 , 3 Внутри дрозофилы нейромышечный переход (NMJ) позволяет анализировать как клеточные, так и электрофизиологические свойства и оказался важной системой для изучения нервно-мышечного заболевания из-за видимого nЭврон-мышечные связи. 2 В этом исследовании мы описываем анализ травм in vivo нейронов у личинок дрозофилы, который позволяет воспроизводить повреждение сегментных нервов. Эта травма мотонейронов приводит к временной последовательности клеточных событий, приводящей к нейродегенерации при 38-часовой травме NMJ. Способность воспроизводственно травмировать мотонейроны, приводящие к нейродегенерации, имеет разнообразные применения, такие как идентификация специфических генов, необходимых для дегенеративного процесса, раскрытие транскрипционных ответов на повреждение нейронов и анализ защитных сигнальных каскадов. 4 , 5 , 6 Этот метод также использовался в сочетании с микрофлюидикой для изучения дегенерации нейронов и регенерации у живых животных. 7
Мы используем установленный количественный анализ для изучения дегенерации моторных нейроновИон на Drosophila NMJ после механического повреждения. Этот анализ основан на том факте, что потеря пресинаптической мембраны и белков предшествует разборке сусинаптического ретикулума (SSR), характеризующегося складками постсинаптической мышечной мембраны. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Этот анализ позволяет количественно определить «синаптические следы», где пресинаптический нейрон потерял связь с соседней постсинаптической мышцей. Показано, что дегенеративный процесс является прогрессирующим в течение развития личинок 12 и не может быть объяснен измененным развитием синапса или прорастанием. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 ОбъявлениеПреимущество использования механического повреждения перед существующими мутациями заключается в том, что он позволяет рассекать временную последовательность клеточных событий, ведущих к нейродегенерации в NMJ. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
Обнаруженная здесь нейронная механическая травма может быть использована для индуцирования травмы / стресса в сегментных нервах личинок дрозофилы . 4 , 5 , 6 , 14 Этот экспериментальный метод был использован ранее ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить всех членов Лаборатории Келлера и Маги в Университете Куиннипак за полезные предложения. В частности, мы хотели бы поблагодарить Barron L. Lincoln II за разработку этого теста на рану в лаборатории Keller. Мы также хотели бы поблагодарить Куиннипакский университетский колледж искусств и науки «Грант-ин-Эйд», присужденный LC Keller.
Materials
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased/ |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
- Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
- Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
- Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
- Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
- Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
- Lincoln, B. L., Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).
- . Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).
