Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokol for lav-overflod embryonale prøver
Summary
Her, beskriver vi en kromatin immunoprecipitation (ChIP) og ChIP-seq bibliotek forberedelse protokol til at generere globale epigenomiske profiler fra lav-overflod kylling embryonale prøver.
Abstract
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) er en meget udbredt teknik til kortlægning af lokalisering af post-translationally modificerede histoner, Histon varianter, transkriptionsfaktorer eller ændring af kromatin enzymer i en given locus eller på en genome-wide skala. Kombinationen af ChIP assays med næste generation sequencing (dvs., ChIP-FF.) er en kraftfuld tilgang til globalt afdække gen regulerende net og at forbedre den funktionelle anmærkning af genomer, især ikke-kodende regulerende sekvenser. ChIP protokoller kræve normalt store mængder af cellulære materiale, således udelukker anvendeligheden af denne metode til at undersøge sjældne celletyper eller lille væv biopsier. For at gøre ChIP assay kompatibel med mængden af biologisk materiale, der kan typisk fås i vivo under tidlige hvirveldyr embryogenese, vi beskriver her en forenklet ChIP protokol, hvor antallet af trin kræves for at fuldføre den analysen var reduceret for at minimere prøve tab. Denne ChIP protokollen har held været anvendt til at undersøge forskellige Histon ændringer i forskellige embryonale kylling og voksen mus væv ved hjælp af lav til medium celle numre (5 x 104 – 5 x 105 celler). Vigtigst, denne protokol er kompatibel med ChIP-seq teknologi ved hjælp af standard biblioteket præparationsmetoder, hvilket giver global epigenomiske kort i yderst relevant embryonale væv.
Introduction
Histon posttranslationelle modifikationer er direkte involveret i forskellige kromatin-afhængige processer, herunder transskription, replikering og DNA reparation1,2,3. Desuden forskellige Histon ændringer viser positive (fx H3K4me3 og H3K27ac) eller negativ (f.eks. H3K9me3 og H3K27me3) korrelationer med genekspression og kan defineres bredt som aktiverende eller undertrykkende Histon markerer, henholdsvis2,3. Derfor, globale Histon ændring kort, også benævnt epigenomiske kort, er dukket op som stærke og universel værktøj funktionelt anmærke hvirveldyr genomer4,5. Eksempelvis distale regulerende sekvenser som smagsforstærkere kan identificeres baseret på tilstedeværelsen af specifikke kromatin signaturer (f.eks. aktive smagsforstærkere: H3K4me1 og H3K27ac), som adskiller dem fra proksimale promotor regioner (f.eks. aktive initiativtagere: H3K4me3)6,7,8. På den anden side findes gener med store celle identitet regulering funktioner typisk med bred kromatin domæner mærket med H3K4me3 eller H3K27me3, afhængigt af de underliggende gener, transcriptionally aktive eller inaktive status henholdsvis9 ,10. Ligeledes synes udtryk for store celle identitet gener skal kontrolleres ofte af flere og rumligt grupperet smagsforstærkere (dvs., super-forstærkere), der kan identificeres som brede H3K27ac-mærkede domæner11.
I øjeblikket genereres Histon ændring maps ved hjælp af ChIP-seq teknologi, som i forhold til tidligere metoder såsom ChIP-chip (ChIP koblet til microarrays) giver højere opløsning, færre artefakter, mindre støj, større dækning og lavere koster12. Generation af epigenomiske kort med ChIP-seq teknologi har ikke desto mindre, dens iboende begrænsninger, for det meste forbundet med kapacitet til at fuldføre ChIP i prøver af interesse. Traditionelle ChIP protokoller kræves typisk millioner af celler, hvor de grænseværdier for anvendelsen af denne metode til in vitro celle linjer eller celler der kan nemt være isoleret i vivo (f.eks. blod celler). I de sidste par år, har en række modificerede ChIP protokoller kompatibel med lav celle numre blevet beskrevet13,14,15,16. Men disse protokoller er specielt designet til at være sammen med next generation sequencing (dvs., ChIP-FF.), og de bruger typisk ad hoc- bibliotek forberedelse metoder13,14, 15 , 16.
Her, vi beskrevet en ChIP protokol, der kan bruges til at undersøge Histon ændring profiler ved hjælp af lav til mellemliggende celle numre (5 x 104 – 5 x 105 celler) på enten valgte loci (dvs., ChIP-qPCR) eller globalt (dvs. ChIP-seq) (figur 1). Når koblet til ChIP-seq teknologi, kan vores ChIP protokollen bruges sammen med standard biblioteket forberedelse metoder, således at gøre det bredt tilgængeligt for mange laboratorier10. Denne protokol er blevet brugt til at undersøge flere Histon mærker (f.eks. H3K4me3, H3K27me3 og H3K27ac) i forskellige kylling embryonale væv (f.eks, spinal neurale rør (SNT), frontonasal protuberanser og epiblast). Vi forventer dog, at det bør være bredt gælder for andre organismer, som biologisk og/eller klinisk relevante prøver kan kun fås i små mængder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epigenomiske profilering af Histon ændring ved hjælp af ChIP-seq kan bruges til at forbedre den funktionelle anmærkning af hvirveldyr genomer i forskellige cellulære sammenhænge4,5,18. Disse epigenomiske profiler kan blandt andet bruges til at identificere enhancer elementer, til at definere den regulerende stat af smagsforstærkere (dvs. aktiv, primet, eller klar) og definere store celle identitet reguleringsmyndi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Jan Appel for hans fremragende teknisk bistand under etableringen af denne protokol. Arbejde i Rada-Iglesias laboratorium er understøttet af CMMC murene finansiering, DFG forskningsbevillinger (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 og TE 1007/3-1), UoC avancerede forsker gruppe Grant og CECAD Grant.
Materials
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100-1000µl Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2-20µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2-200µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5-10µl Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10ml) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5–1,000 μl) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
References
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. Characterization of human epigenomes. Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
- Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
- Ho, J. W. K., et al. Comparative analysis of metazoan chromatin organization. Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).
- Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?. Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
- Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
