Præcis, høj overførselshastighed analyse af bakterievækst
Summary
Kvantitative evaluering af bakteriel vækst er nødvendigt for at forstå mikrobiel fysiologi som en systemniveau fænomen. En protokol til eksperimentelle manipulation og en analytisk tilgang introduceres, giver mulighed for præcis, høj overførselshastighed analyse af bakteriel vækst, som er et centralt emne af interesse i systembiologi.
Abstract
Bakterievækst er et centralt begreb i udviklingen af moderne mikrobiel fysiologi samt i undersøgelsen af cellulære dynamics på systemer plan. Nylige undersøgelser har rapporteret korrelationer mellem bakterievækst og genome-wide begivenheder, såsom genom reduktion og transkriptom reorganisering. Korrekt analysere bakterievækst er afgørende for at forstå den vækst-afhængige koordinering af genet funktioner og cellulære komponenter. Det er derfor nødvendigt præcis kvantitativ evaluering af bakteriel vækst på en måde, høj overførselshastighed. Nye teknologiske udvikling tilbyder nye eksperimentelle værktøjer, der tillader opdateringer af de benyttede metoder til at studere bakterievækst. I protokollen indføres her beskæftiger en mikrotiterplade læseren med en stærkt optimeret eksperimentel procedure for den reproducerbare og præcis vurdering af bakterievækst. Denne protokol blev brugt til at evaluere vækst af flere tidligere beskrevet Escherichia coli stammer. De vigtigste trin i protokollen er som følger: udarbejdelse af et stort antal celle bestande i små hætteglas for gentagne forsøg med reproducerbare resultater, brug af 96-brønd plader for høj overførselshastighed vækst evaluering og manuel beregning af to store parametre (dvs., maksimal vækst sats og befolkningen tæthed) repræsenterer vækst dynamics. I forhold til den traditionelle kolonidannende enhed (CFU) analyse, som tæller de celler, der er kulturperler i glasrør over tid på agar plader, den nuværende metode er mere effektiv og giver mere nøjagtige tidsmæssige optegnelser over vækst ændringer, men har en strengere detektionsgrænsen på lav befolkningstæthed. I Resumé er den beskrevne metode fordelagtig for den nøjagtige og reproducerbare høj overførselshastighed analyse af bakteriel vækst, som kan bruges til konceptuelle konklusioner eller at gøre teoretiske betragtninger.
Introduction
Mikrobiologiske undersøgelser starte ofte med kulturen i bakterieceller og vurderingen af bakterievækst kurver, som repræsenterer et grundlæggende fænomen for bakteriel fysiologi1,2,3. Grundlæggende kultur principper er bredt tilgængelige i offentliggjort forskningslitteratur og lærebøger, fordi bakteriekulturen er en grundlæggende metode. På niveauet bænk betydelig opmærksomhed har traditionelt været fokuseret på optimering vækst medier og dyrkning betingelser, men kontrollerer vækstraten, der vil sandsynligvis give endnu større forståelse af mikrobiel fysiologi, har ikke været grundigt undersøgte4. For eksponentielt voksende bakterier, er en vigtigste parameter i den cellulære stat den vækstrate, der er blevet rapporteret at være samordnet med den genom og transkriptom, proteom5,6,7,8 . Kvantitative evaluering af bakteriel vækst er således afgørende for forståelsen af mikrobiel fysiologi.
For at evaluere bakterievækst, eksperimentelle metoder til at anslå biomasse er veletableret9,10 og er baseret på påvisning af biokemiske, fysiske eller biologiske parametre, såsom optiske turbiditet. Derudover er de analysemetoder, der anvendes til at fange de dynamiske egenskaber af væksten ændringer almindeligt baseret på etablerede ikke-lineære modeller11,12,13, eksempelvis logistic ligninger. Vækst dynamics er generelt erhvervet timet stikprøveanalyse af cellevækst i kultur af enten måling optisk turbiditet eller udfører kolonidannende enhed (CFU) assays. Begrænsning af disse dyrkning og påvisning metoder er at datapunkterne ikke er et sandt billede af populationsdynamikken, fordi måling intervaller er ofte i timer og kultur betingelse (f.eks.ændringer i temperatur og beluftning) er forstyrret på tidspunktet for prøveudtagningen. Kultur og analyse teknikker skal opdateres ved hjælp af den seneste udvikling i teknologi og forståelse. De seneste fremskridt i mikrotiterplade læsere giver mulighed for real-time observation af bakterievækst og betydeligt reducere omkostninger til arbejdsløn. Brug disse avancerede enheder, har de seneste undersøgelser på bakteriel vækst rapporteret analysemetoder til høj overførselshastighed målinger14,15.
Formålet med denne protokol er at vurdere den præcise vækst dynamik i en høj overførselshastighed måde, som vil være værdifuld for kvantitative undersøgelser, der i sidste ende løse spørgsmålene om hvordan væksten bestemmes og hvilke faktorer påvirker vækstraten. Protokollen adresser alle faktorer, der bør tages hensyn til den gentagelig og præcis kvantificering af bakterievækst. Den eksperimentelle metode og analyse er beskrevet i detaljer i hovedteksten. Denne metode tillader den nøjagtige og reproducerbare analyse af bakterievækst i en høj overførselshastighed måde. Mikrobiologer kan bruge denne protokol til at udlede yderligere kvantitative resultater fra deres eksperimentelle bevismateriale. Denne protokol kan også bruges til studier i systembiologi, der forsøger at drage grundlæggende konklusioner eller at opnå en teoretisk overblik over vækst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trin i protokollen omfatter udarbejdelse af en fælles bestand af eksponentielt voksende celler og replikering af de samme prøver i flere brønde på forskellige positioner på en mikrotiterplade. Tidligere, mikrobiologer startede kulturen fra en overnatning før kultur. Denne metode kan reducere tidsforsinkelsen for bakteriel vækst, men det er vanskeligt at opnå reproducerbare vækstkurver. Som vist i figur 2, resulterede de uafhængige målinger ved hjælp af de fælles glycero…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Materials
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
References
- Kovarova-Kovar, K., Egli, T. Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).
- Soupene, E., et al. Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression. J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Egli, T. Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship. Front Microbiol. 6, 287 (2015).
- Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. Correlation between genome reduction and bacterial growth. DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).
- Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria. BMC Genomics. 14, 808 (2013).
- Nahku, R., et al. Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures. J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).
- Dai, X., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth. Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).
- Madrid, R. E., Felice, C. J. Microbial biomass estimation. Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).
- Harris, C. M., Kell, D. B. The estimation of microbial biomass. Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).
- Yates, G. T., Smotzer, T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves. J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).
- Kargi, F. Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics. Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).
- Sprouffske, K., Wagner, A. Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves. BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).
- Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. Growth rates made easy. Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).
- Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates. Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).
- Engen, S., Saether, B. E. r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success. Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).
