細菌の増殖の高精度、高スループットの分析
Summary
細菌の成長の定量的評価はシステム レベルの現象として微生物生理学の理解に不可欠です。システム生物学への関心のキーの対象は、細菌の増殖の高精度、高スループットの分析を可能にする、実験的操作および分析的なアプローチのためのプロトコルを紹介します。
Abstract
細菌の増殖は、近代の微生物生理学の開発だけでなくシステム レベルでの細胞動態の調査、中心的な概念です。最近の研究では、細菌の増殖とゲノムの削減とトランスクリプトームの再編成など、ゲノム全体のイベント間の相関を報告しています。正しく細菌の増殖を分析は、遺伝子の機能と細胞成分の成長に依存した調整を理解することにとって重要です。したがって、高スループット方法で細菌の増殖の正確な定量的評価が必要です。新興の技術開発は、細菌の増殖を研究するために使用されるメソッドの更新が可能な新しい実験的なツールを提供しています。ここで紹介したプロトコルでは、細菌の増殖の再現性と正確な評価のための非常に最適化された実験手順をマイクロ プレート リーダーを採用しています。このプロトコルは、いくつかの成長を評価に使用した前述のエシェリヒア属大腸菌の緊張。プロトコルの主な手順は次のとおりです: 再現性のある結果、高スループット成長評価の 96 ウェルのプレートの使用の 2 つの大きな手動計算とテストを繰り返して多数の小さな瓶で細胞株の準備(すなわち、最大成長率と人口密度) のパラメーター成長ダイナミクスを表します。伝統的なコロニー形成単位 (CFU) 試金、ガラス管で寒天プレート上で培養している細胞をカウントと比較して本法が効率的ですと成長変化の詳細の時間的な記録を提供しますより厳格です低い人口密度で検出限界。要約すると、この方法は結論を概念や理論的な観察をする使用ことができます細菌の増殖の正確かつ再現可能な高スループット分析のため有利です。
Introduction
微生物学的研究は、しばしば細菌細胞の培養と細菌の生理1,2,3の基礎的な現象を表す細菌の増殖曲線の評価開始します。基本的な文化の原則は、細菌培養は基本的な方法論研究発表文献や教科書で広く利用可能です。ベンチのレベルに実質的な伝統的に注目されている成長媒体の最適化と培養条件しますが、成長率を制御する、微生物生理学の一層の理解を提供するだろう可能性が高いされていません。広範囲に研究4。指数関数的に増殖する細菌、細胞の状態の重要なパラメーターは成長率は、ゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム5,6,7,8 と調整が報告されています。.従って、細菌の増殖の定量的評価は微生物生理学を理解するため重要です。
細菌の増殖を評価するには、バイオマスを推定する実験手法確立9,10と光濁度など、生化学的、物理的または生物学的パラメーターの検出に基づいています。さらに、成長変化の動的特性をキャプチャするための分析手法はよく確立された非線形モデル11,12,13, たとえば、ロジスティック方程式に基づいています。成長ダイナミクスは文化の細胞の成長の時間サンプリングによる光濁度を測定またはコロニー形成単位 (CFU) 試金の実行によって一般に取得されます。これらの培養と検出法の制限は、データ ポイントは個体群動態の本当の反射の測定間隔時間で多くの場合、ため培養条件 (例えば温度の変化と曝気) は、サンプリング時に邪魔されてます。文化・解析技術は、技術と理解の最近の進歩を使用して更新する必要があります。マイクロ プレート リーダーの最近の進歩は、細菌の増殖のリアルタイム観察を可能し、人件費を大幅に削減します。これらの高度なデバイスを使用して、細菌の増殖に関する最新の研究は、高スループット測定14,15分析法を報告しています。
このプロトコルの目的は、最終的に成長率を決定する方法と、どのような要因に影響を与える成長率の質問に対処する量的研究の価値があるでしょう高スループット方法で正確な成長ダイナミクスを評価することです。プロトコル細菌の増殖での再現性と正確な定量の考慮する必要がありますすべての要因に対処します。実験方法と分析は、メイン テキストで詳細に説明します。このメソッドでは、高スループット方法で細菌の増殖の正確かつ再現性の高い分析ができます。微生物学者たちは、その実験的証拠から追加の量的な結果を導き出すにこのプロトコルを使用できます。このプロトコルは、概念的な結論を描画するまたは成長の理論的概要を達成するためにしようとするシステムバイオロジーの研究も使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルの重要なステップには、普通株式の指数関数的に成長のセルやマイクロ プレートの様々 な位置に複数の井戸で同じサンプルのレプリケーションの準備が含まれます。以前は、微生物学者は、一晩前文化から文化を始めた。このメソッドは、細菌の増殖のタイムラグを減らすことができます、再現性のある成長曲線を実現することは困難です。図 2のように、…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者が明らかに何もありません。
Materials
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
References
- Kovarova-Kovar, K., Egli, T. Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).
- Soupene, E., et al. Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression. J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Egli, T. Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship. Front Microbiol. 6, 287 (2015).
- Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. Correlation between genome reduction and bacterial growth. DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).
- Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria. BMC Genomics. 14, 808 (2013).
- Nahku, R., et al. Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures. J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).
- Dai, X., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth. Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).
- Madrid, R. E., Felice, C. J. Microbial biomass estimation. Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).
- Harris, C. M., Kell, D. B. The estimation of microbial biomass. Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).
- Yates, G. T., Smotzer, T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves. J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).
- Kargi, F. Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics. Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).
- Sprouffske, K., Wagner, A. Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves. BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).
- Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. Growth rates made easy. Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).
- Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates. Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).
- Engen, S., Saether, B. E. r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success. Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).
