Analyse précise, haut débit de la croissance bactérienne
Summary
Une évaluation quantitative de la croissance bactérienne est essentielle pour comprendre la physiologie microbienne comme un phénomène de niveau système. Un protocole pour la manipulation expérimentale et une approche analytique sont introduites, permettant une analyse précise et à haut débit de la croissance bactérienne, qui est un sujet clé d’intérêt en biologie des systèmes.
Abstract
La croissance bactérienne est un concept central dans le développement de la physiologie microbienne moderne, ainsi que dans l’investigation de la dynamique cellulaire au niveau des systèmes. Des études récentes ont rapporté des corrélations entre la croissance bactérienne et les événements de génome, comme la réorganisation de la réduction et le transcriptome du génome. Analyser correctement la croissance bactérienne est cruciale pour comprendre la coordination axées sur la croissance des fonctions des gènes et des composants cellulaires. Par conséquent, l’évaluation quantitative précise de la croissance bactérienne de manière haut débit est requise. Nouveaux développements technologiques offrent de nouveaux outils expérimentaux qui permettent des mises à jour des méthodes utilisées pour l’étude de la croissance bactérienne. Le protocole présenté ici utilise un lecteur de microplaques avec une procédure expérimentale hautement optimisé pour l’évaluation précise et reproductible de la croissance bactérienne. Ce protocole a été utilisé pour évaluer la croissance de plusieurs précédemment décrit des souches d’Escherichia coli . Les principales étapes du protocole sont les suivants : la préparation d’un grand nombre de stocks de cellules de petites fioles pour essais répétés avec des résultats reproductibles, l’utilisation des plaques à 96 puits, pour l’évaluation de la croissance du haut débit et le calcul manuel de deux grandes paramètres (p. ex., densité de population et taux de croissance maximal) qui représente la dynamique de croissance. En comparaison avec le test d’unité (CFU) formatrices traditionnels, qui compte les cellules qui sont cultivées dans des tubes de verre au fil du temps sur milieu gélosé, la présente méthode est plus efficace et fournit des notices plus détaillées temporelles des variations de croissance, mais a une plus stricte limite de détection à faible densité de population. En résumé, la méthode décrite est avantageuse pour l’analyse précise et reproductible de haut débit de la croissance bactérienne, qui peut être utilisée pour tirer des conclusions conceptuelles ou de présenter des observations théoriques.
Introduction
Des études microbiologiques commencent souvent avec la culture de cellules bactériennes et l’évaluation des courbes de croissance bactérienne, qui représentent un phénomène fondamental de la physiologie bactérienne1,2,3. Principes de base de la culture sont largement disponibles dans la littérature de recherche publiés et les manuels scolaires parce que la culture bactérienne est une méthodologie fondamentale. À l’échelle de banc, une attention particulière a traditionnellement été axée sur l’optimisation des milieux et des conditions de culture, mais contrôle le taux de croissance, qui permettrait sans doute une plus grande compréhension de la physiologie microbienne, n’a pas été étudiés4. Pour les bactéries en croissance exponentielle, un paramètre-clé de l’État cellulaire est le taux de croissance, qui a été rapporté pour être coordonné avec le génome, transcriptome et du protéome5,6,7,8 . Ainsi, une évaluation quantitative de la croissance bactérienne est cruciale pour comprendre la physiologie microbienne.
Pour évaluer la croissance bactérienne, les méthodes expérimentales utilisées pour estimer la biomasse sont bien établis9,10 et sont basées sur la détection des paramètres biochimiques, physiques ou biologiques, telles que la turbidité optique. En outre, les méthodes analytiques utilisées pour capturer les propriétés dynamiques des changements de croissance couramment reposent sur des modèles non linéaires établi11,12,13, par exemple, les équations logistiques. Dynamique de croissance est généralement acquises par échantillonnage chronométré de la croissance des cellules en culture par mesure de turbidité optique ou effectuant des tests d’unité (CFU) formatrices. La limitation de ces méthodes de détection et de mise en culture, c’est que les points de données ne sont pas un reflet fidèle de la dynamique des populations, parce que les intervalles de mesure sont souvent en heures et que la condition de la culture (p. ex., changements de température et aération) est perturbée au moment de l’échantillonnage. Techniques de culture et d’analyse doivent être actualisés à l’aide des développements récents dans la technologie et la compréhension. Les progrès récents dans des lecteurs de microplaque permettent l’observation en temps réel de la croissance bactérienne et diminuent considérablement les coûts de main-d’œuvre. En utilisant ces dispositifs avancés, les dernières études sur la croissance bactérienne ont signalé des méthodes analytiques pour les mesures haut débit14,15.
Le but du présent protocole est d’évaluer la dynamique de croissance précis d’une manière de haut débit, qui est très utile pour les études quantitatives qui finalement répondre aux questions de la façon dont le taux de croissance est déterminé et quels facteurs influent sur le taux de croissance. Le protocole porte sur tous les facteurs qui doivent être pris en compte pour la quantification précise et reproductible de la croissance bactérienne. La méthode expérimentale et l’analyse sont décrites en détail dans le texte principal. Cette méthode permet l’analyse précise et reproductible de la croissance bactérienne dans une manière de haut débit. Microbiologistes peuvent utiliser ce protocole, de déduire des résultats quantitatifs supplémentaires leurs preuves expérimentales. Ce protocole peut également servir pour les études en biologie des systèmes qui tentent de tirer des conclusions conceptuelles ou pour obtenir un aperçu théorique de la croissance.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes critiques du protocole comprennent la préparation d’un stock commun en croissance exponentielle des cellules et la réplication des mêmes échantillons dans plusieurs puits à différentes positions sur la microplaque. Auparavant, microbiologistes ont commencé la culture d’une culture avant une nuit ou plus. Alors que cette méthode peut réduire le temps de latence de la croissance bactérienne, il est difficile d’obtenir des courbes de croissance reproductibles. Comme illustré à la <strong class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Materials
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
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