AFM und Microrheology in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle
Summary
Das Fehlen von Instrumenten zur Messung von Materialeigenschaften und Zug Parameter in Vivo verhindert Validierung ihrer Rolle während der Entwicklung. Wir beschäftigten Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Nanopartikel-Tracking, mechanische Eigenschaften auf die intakte Zebrafish Embryos Eigelb Zelle während der Epiboly zu quantifizieren. Diese Methoden sind zuverlässig und vielseitig einsetzbar, aufdringliche Interventionen zu vermeiden.
Abstract
Aufklärung der Faktoren, die die räumlich-zeitliche Organisation der sich entwickelnden Gewebe direkt ist einer der Hauptgründe für die Verwendung in der Studie der Entwicklung. Verschiedene Thesen behaupten, wichtige Beiträge zum Verständnis der mechanischen Eigenschaften von Zellen und Geweben in ihrer raumzeitlichen Organisation in verschiedenen Entwicklungs- und morphogenetischen Prozessen gewesen zu sein. Jedoch wegen des Mangels an zuverlässige und zugängliche Tools zur Messung von Materialeigenschaften und Zug Parameter in Vivo, war Überprüfung dieser Hypothesen schwierig. Hier stellen wir Ihnen Methoden beschäftigt Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Teilchen verfolgen mit dem Ziel, die mechanischen Eigenschaften der intakten Zebrafish Embryos Eigelb Zelle während der Epiboly zu quantifizieren. Epiboly ist eine frühe konservierten Entwicklungsprozess, dessen Studie durch die Transparenz des Embryos erleichtert wird. Diese Methoden sind einfach zu implementieren, zuverlässig und vielseitig einsetzbar, da sie aufdringliche Interventionen überwinden, die Gewebe Mechanik beeinflussen könnten. Eine einfache Strategie wurde für die Montage von Proben, AFM-Aufnahme und Nanopartikel-Injektionen und Nachverfolgung angewendet. Dieser Ansatz macht diese Methoden leicht anpassbar an andere Entwicklungsstörungen Zeiten oder Organismen.
Introduction
Die physikalischen Grundsätze der biomechanischen Kontrolle der morphogenetischen Prozesse sind weitgehend undefiniert. Während biomechanische Untersuchungen auf molekularer und zellulärer Ebene erhebliche an Schwung, ist die Erforschung der biomechanischen Parameter der Ebene der Gewebe/Organismus in seiner Kindheit. Hydrodynamische Regression1 oder Video-Kraft-Mikroskopie2 Forscher, aktive und passive Kräfte, während der Laser Mikrochirurgie3oder weniger aufdringlich Rasterkraftmikroskopie (AFM) dissoziierten Zellen4 unterscheiden können oder in vivo 5 oder Nanopartikel Microrheology6 erlauben die Vorfreude der mechanischen Eigenschaften und Reaktionen des Gewebes.
AFM ist eine dreidimensionale topographische Technik mit hoher atomarer Auflösung Oberflächenrauhigkeit und Compliance aus der Durchbiegung der Freischwinger Tipps beim Kontakt mit einem sondierten Oberfläche7zu lösen. Verschiedene Methoden mit AFM wurden entwickelt, um Oberflächeneigenschaften, einschließlich der Messung von Reibung, Adhäsionskräfte und viskoelastischen Eigenschaften verschiedener Materialien zu untersuchen. AFM hat vor kurzem ein mächtiges Werkzeug zum Abrufen von Informationen auf die mechanischen Eigenschaften von biologischen Proben entwickelt. AFM kann insbesondere nicht-invasiv der komplexe Schubmodul aus einzelnen Zellen extrahieren, durch die Anwendung von oszillierender Vertiefungen mit einem Mikro Spitze an einem Freischwinger von bekannten Biegung konstant8befestigt. Dadurch können wir die daraus resultierenden Kräfte abzuleiten. Doch AFM ist nicht eindeutig und verschiedene Methoden erlauben extrahieren Daten rheologischen und mechanischen Eigenschaften von einzelnen Zellen (z. B. Mikropipette streben9, magnetische Zytometrie (MTC)10verdrehen oder einachsigen Zug- 11Tests).
Die Anwendung dieser neuartigen Methoden komplexe morphogenetischen Prozesse ist jedoch nicht einfach. Die größten Herausforderungen bei der Bestimmung der mechanischen Eigenschaften des embryonalen Gewebe sind die kleinen (µm bis mm), weich (in den 102 – 104 -Pa-Bereich) und Visco-elastische (entstehen auf zeitabhängige Phänomene) Natur der materiellen12. Es ist daher wichtig, die Methoden zur Bestimmung der mechanischen Eigenschaften (Steifigkeit, Viskosität, Adhäsion) auf den konkreten Fall von Embryonen und entwickelnden Organismen anzupassen. Zwei wichtige Punkte müssen berücksichtigt werden bei der Analyse der rheologische Ansätze zur Entwicklung zu studieren: aufdringlich Störungen zu vermeiden und gute Erreichbarkeit. In diesem Szenario zeigen Mikropipette Aspiration, MTC und Zugprüfung Einschränkungen. Im ersten Fall könnte die hohe Verformung, die eine Zelle leidet seine physiologischen und mechanischen Eigenschaften9ändern. Im zweiten Fall könnte die Notwendigkeit, sich fest das experimentelle Gewebe auf ein Substrat um sicherzustellen, dass die Spannungen angewendet das Zellskelett lokal verformen auch Auswirkungen auf die Zellen der Aktivierungsstatus und daher in ihrer mechanischen Eigenschaften10 bringen. . Letzte, einachsigen Zug-Ansätze werden durch die Geometrie der Entwicklung von Organismen und Zugänglichkeit11begrenzt.
AFM scheint für das Studium der Entwicklungsprozesse besser geeignet sein, wie es die Untersuchung von biologischen Proben direkt in ihrer natürlichen Umgebung ohne umständliche Probenvorbereitung ermöglicht. Darüber hinaus wie Dissoziation des embryonalen Gewebe in der Regel schwierig ist, bietet die geringere Größe der AFM Sonden ein hohes Maß an Vielseitigkeit ohne Einschränkung bei der Wahl der Art des Mediums (wässrige oder nichtwässrigen), Probentemperatur oder chemische Zusammensetzung der Probe. AFM ist vielseitig genug, um auf große Domänen angewendet werden und Zeitskalen und zum Abrufen von Eigenschaften von Gewebe in unterschiedlichen Entwicklungsstadien oder physiologischen Bedingungen beschäftigt. Gesamten nativen Gewebe wie Arterien13 oder Knochen14 untersucht worden sind, aus Sicht der topographischen und in einigen Fällen, wie der Sklera, mechanische Eigenschaften wurden auch abgerufen am15. Topographie ist auch in live ermöglicht die Visualisierung von zum Beispiel Zelle Umlagerung während Morphogenese Xenopus16Embryonen untersucht worden. Letzten, umfassenden Stichprobe Vorbereitung Protokolle wurden entwickelt, um mechanische Parameter zu bestimmen, während verschiedene Entwicklungsprozesse. Nanoindentation Karten wurden auf native fixierten Gewebeschnitten für die Küken embryonalen Verdauungstrakt11generiert; Kleber und mechanische Eigenschaften für einzelne Ektoderm, Mesoderm und Entoderm Progenitor-Zellen isoliert von gastrulating Zebrafish Embryos4abgerufen; Steifigkeit Messungen für die Epiblast und primitive Streak auf Explantaten von Vogelgrippe Embryonen17; und ein eindeutiges Muster von Steifigkeit Gradienten direkt im embryonalen Gehirn von Xenopus5definiert.
Annäherung an einfach zugänglichen morphogenetischen Prozesse kann ein erheblicher Qualitätssprung für die Anwendung von AFM für die Erkundung der Embryonalentwicklung entstehen. Zebrafisch-Epiboly ist ein wesentlicher und konservierte Ereignis, in dem verschiedene Geweben auf engstem Raum kugelförmig um den Ausbau der Blastoderm in wenigen Stunden direkte koordinieren. Zu Beginn der Zebrafisch Epiboly (sphärische Bühne) deckt eine oberflächliche Schicht von Zellen, die umhüllende Schicht (EVL), eine halbkugelförmige Kappe von Blastomeren auf die Tier-Pole des Embryos sitzt auf einer massiven Eigelb syncytial Zelle zentriert. Epiboly besteht aus den kortikalen pflanzlichen Ward Ausbau der EVL die tiefen Zellen (DCs) das Blastoderm und die äußere Schicht der syncytial Eigelb Zelle (E-YSL) um den Dotter. Epiboly endet mit der Schließung der EVL und die DCs Vegetal Pfosten18,19,20. Wie und wo Kräfte während Epiboly generiert werden und wie sie weltweit gekoppelt sind, ist nicht noch klar,1,21.
Hier beschreiben wir im Detail wie AFM zu folgern, dass passive mechanische Gewebeeigenschaften während Epiboly Progression im Zebrafisch Eigelb in VivoZelle angewendet. Dazu haben wir kleine Mikrosphären mit AFM Kragarmen als Sonden verbunden beschäftigt. Dies ermöglicht den Abruf von präzise lokale Informationen innerhalb der Zelloberfläche ungleichmäßige Eigelb und Zug Steigungen und ihre Dynamik im Laufe der Zeit zu studieren. Alternative AFM nähert sich z. B. die Verwendung von Keil Kragarme22, wird nicht Lokaldaten Render, die präzise genug ist. Die Keil-Technik, die sehr sorgfältige Handhabung Fähigkeiten, um einen Keil größer als die Größe der Stichprobe am Ende des Nadelträgers kleben erfordert, eignet sich nicht zum sondieren Embryo (~ 2-fach größer als die Länge des Nadelträgers) Mechanik.
Modellierung und Charakterisierung der viskoelastischen Eigenschaften der Zellen in qualitativer und quantitativer Hinsicht ermöglicht ein besseres Verständnis für die Biomechanik. Aus biomechanischer Sicht ist es wichtig zu verstehen, Epiboly und nicht nur Nachfrage wissen über Messungen der kortikalen Spannung und Dynamik, die durch AFM extrahiert werden können; so gibt es Bedarf an Informationen über die biophysikalischen Eigenschaften des Gewebes. Um diese Informationen zu extrahieren, eine Vielzahl von Zelle Rheologie Techniken wurden entwickelt, in den Jahren um verschiedene Zelltypen unter verschiedenen physiologischen Bedingungen23charakterisieren. Dazu gehören AFM, MTC und optische Pinzette (OT). Diese Methoden sind jedoch unzureichend für mesoskopische Analysen auf der Ebene der Embryonen oder Organen nachgewiesen worden. Als Alternative haben wir erfolgreich Nanopartikel-Tracking Microrheology6 für in Vivo rheologischen Messungen angepasst. Diese Technik analysiert die Brownschen Verschiebungen einzelner Partikel und schließt lokale mikromechanische Eigenschaften.
Zusammen AFM und Nanopartikel Microrheology erlauben die Definition der kortikalen Zug Dynamik und internen mechanischen Eigenschaften von Eigelb während Epiboly. Diese Informationen unterstützt voll und ganz eine Modell in dem anisotropen Stress entwickelt sich als Folge der Unterschiede in der Verformung Antwort von der EVL und die Eigelb zytoplasmatischen Schicht (YCL) zu den isotropen Actomyosin Kontraktion des E-YSL Kortex ist wichtig für net Richtungsbewegung der EVL und Epiboly Progression1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier zeigen wir, dass die Materialeigenschaften und einige biomechanischen Parameter der Zebrafisch Eigelb Zelle während der Epiboly von AFM und Nanopartikel Microrheology leicht geschätzt werden können.
Während AFM, zum Abrufen von rheologischer Eigenschaften von Zellen und Geweben in physiologischen Bedingungen4,5,25,28 beschäftigt war, haben hier wir ein Prot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Amayra Hernandez-Vega und Philippe Alexandre Pouille für die Teilnahme an die Grundlage für diese Protokolle einrichten. Wir danken auch der Molecular Imaging Plattform vom IBMB-PCB, Xavier Esteban und Mitglieder des Labors für kontinuierliche Unterstützung. Das konsolidierte Gruppen Programm der Generalitat de Catalunya und DGI und Consolider Zuschüsse aus dem Ministerium für Wirtschaft und die Wettbewerbsfähigkeit von Spanien, EMB und DN unterstützt diese Arbeit.
Materials
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | – | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | – | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 |
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