AFM y Microrheology en la celda de yema de embrión de pez cebra
Summary
La falta de herramientas para medir las propiedades del material y parámetros tensional en vivo impide validar sus papeles durante el desarrollo. Se emplean microscopía de fuerza atómica (AFM) y nanopartículas de seguimiento para cuantificar características mecánicas en la célula de yema de embrión intacto de pez cebra durante epiboly. Estos métodos son fiables y ampliamente aplicables evitando intervenciones intrusivas.
Abstract
Dilucidar los factores que dirigen la organización espacio-temporal de la evolución de los tejidos es uno de los objetivos primordiales en el estudio del desarrollo. Varias proposiciones afirman han sido contribuciones importantes a la comprensión de las propiedades mecánicas de las células y tejidos en su organización espacio-temporal en los diferentes procesos morfogenéticos y de desarrollo. Sin embargo, debido a la falta de herramientas fiables y accesibles para medir las propiedades del material y parámetros tensional en vivo, validación de estas hipótesis ha sido difícil. Aquí presentamos métodos empleando microscopía de fuerza atómica (AFM) y rastreo con el fin de cuantificar las propiedades mecánicas de la célula de yema de embrión de pez cebra intacto durante epiboly de partículas. Epiboly es un proceso conservado principios cuyo estudio es facilitada por la transparencia del embrión. Estos métodos son fáciles de implementar, fiable y ampliamente aplicable ya que superan las intervenciones intrusivas que pueden afectar la mecánica del tejido. Se aplicó una estrategia simple para el montaje de especímenes, grabación de AFM e inyecciones de nanopartículas y seguimiento. Este enfoque hace que estos métodos fácilmente adaptable a otras épocas del desarrollo u organismos.
Introduction
Los principios físicos subyacentes el control biomecánico de procesos morfogenéticos son en gran parte indefinidos. Mientras que estudios biomecánicos en el nivel molecular y celular están cobrando impulso considerable, la exploración de los parámetros biomecánicos en el nivel de tejido/organismo está en su infancia. Hidrodinámica de la regresión1 o Video microscopia de la fuerza2 permiten a los investigadores distinguir fuerzas activas y pasivas, mientras que el láser microcirugía3, o el menos intrusiva microscopía de fuerza atómica (AFM) de células disociadas4 o en vivo 5 o nanopartículas microrheology6 permite la anticipación de respuestas y propiedades mecánicas de los tejidos.
AFM es una técnica topográfica tridimensional de alta resolución atómica resolución de rugosidad de la superficie y el cumplimiento de la desviación de consejos de voladizo al entrar en contacto con una superficie sondeado7. Se han desarrollado diferentes metodologías con AFM para investigar propiedades de superficie, incluyendo medición de fricción, fuerzas de adhesión y propiedades viscoelásticas de materiales diversos. Recientemente, AFM ha emergido como una potente herramienta para recuperar información sobre las propiedades mecánicas de muestras biológicas. En particular, AFM puede extraer forma no invasiva el módulo de corte complejo de las células aplicando sangrías oscilatorias con una punta micro conectada a un voladizo de la constante flexión conocido8. Esto nos permite inferir las fuerzas resultantes. Sin embargo, AFM no es único y diferentes metodologías permiten extraer datos de reología y propiedades mecánicas de las células individuales (p. ej., micropipeta aspiración9, magnético de torsión citometría (MTC)10o uniaxial extensible prueba11).
Sin embargo, la aplicación de estas metodologías novedosas en complejos procesos morfogenéticos no es sencilla. Los principales desafíos que enfrentan al determinar las propiedades mecánicas de los tejidos embrionarios son los pequeños (μm a mm), suave (en el 102 – 104 gama de Pa) y la naturaleza visco-elástica (dando lugar a fenómenos dependientes del tiempo) de los materiales12. Por lo tanto, es importante adaptar los métodos empleados para la determinación de propiedades mecánicas (rigidez, viscosidad, adherencia) para el caso concreto de los embriones y organismos en desarrollo. Dos cuestiones importantes deben tenerse en cuenta al analizar los métodos reológicos para el estudio de desarrollo: para evitar interferencia intrusa y proporcionar accesibilidad. En este escenario, aspiración de la micropipeta, MTC y ensayos de tracción presentan limitaciones. En el primer caso, la alta deformación que sufre una célula podría alterar sus propiedades fisiológicas y mecánicas9. En el segundo caso, la necesidad de adherirse firmemente el tejido experimental a un sustrato para que las tensiones aplicadas deforman el citoesqueleto localmente también puede introducir efectos en el estado de activación de las células y, por lo tanto, en sus características mecánicas10 . Últimos enfoques extensibles uniaxiales están limitados por la geometría de desarrollar organismos y accesibilidad11.
AFM parece ser más adecuado para el estudio de procesos de desarrollo ya que permite el estudio de muestras biológicas directamente en su ambiente natural sin ninguna preparación engorrosa. Por otra parte, como la disociación de los tejidos embrionarios es generalmente difícil, el reducido tamaño de sondas de AFM proporciona un alto grado de versatilidad sin limitación en la elección del tipo de medio (acuoso o no acuoso), temperatura de la muestra o producto químico composición de la muestra. AFM es suficientemente versátil para ser aplicada a grandes dominios y escalas de tiempo y se ha empleado para recuperar propiedades de los materiales de los tejidos en distintas etapas de desarrollo o en condiciones fisiológicas. Conjunto nativos tejidos como las arterias13 o huesos14 han sido estudiados desde un punto de vista topográfico y en algunos casos, como la esclerótica, propiedades mecánicas han sido obtenido15. Topografía se ha explorado también en embriones vivos permitiendo la visualización de, por ejemplo, cambio de celular durante la morfogénesis en Xenopus16. Protocolos de preparación de muestra última y completa se han desarrollado para determinar parámetros mecánicos durante diferentes procesos de desarrollo. Se han generado mapas de nanoindentación en secciones de tejido interpretaciones nativas para la chica tubo digestivo embrionario11; propiedades adhesivas y mecánicas obtenido por ectodermo, mesodermo y endodermo progenitoras células individuales aisladas de embriones de pez cebra gastrulating4; mediciones de rigidez para el epiblasto y la línea primitiva en explantes de embriones aviar17; y un patrón distinto de gradientes de rigidez definida directamente en el cerebro embrionario de Xenopus5.
Un salto cualitativo importante para la aplicación de AFM para explorar desarrollo embrionario puede provenir de acercarse a procesos morfogenéticos acceso sencillos. Pez cebra epiboly es un evento esencial y conservado, en el que diferentes tejidos coordinarán en un espacio esférico restringido para dirigir la expansión del blastoderm en pocas horas. En el inicio de pez cebra epiboly (etapa esférica), una capa superficial de células, la capa envolvente (EVL), cubre una tapa semiesférica de blastómeros centrado en el polo animal del embrión sentado en una célula sincicial yema masiva. Epiboly consiste en la expansión de la cortical ward vegetal de la Vet, las células profundas (DCs) del blastoderm y la capa externa de la célula sincicial yema (E YSL) alrededor de la yema. Epiboly termina con el cierre de la Vet y los controladores de dominio en el polo vegetal18,19,20. Cómo y donde las fuerzas se generan durante el epiboly y cómo se juntan a nivel mundial todavía no está claro de1,21.
Aquí describimos en detalle cómo aplicar AFM para inferir propiedades mecánicas pasivas del tejido durante la progresión del epiboly en la yema de huevo de pez cebra de la célula en vivo. Para ello, empleamos pequeñas microesferas atadas AFM voladizos como sondas. Esto permite la recuperación de información local precisa dentro de la superficie de la célula de yema no uniforme y gradientes tensionales y su dinámica en el tiempo. AFM alternativo enfoques tales como utilizando ménsulas de cuña22, serán datos locales no render que es bastante precisos. La técnica de cuña, que requiere habilidades de manipulación muy cuidadosa para pegar una cuña más grande que el tamaño de la muestra en el extremo del voladizo, no está bien adaptada para sondear el embrión (~ 2 más grande que la longitud del voladizo) mecánica.
Modelado y caracterización de las propiedades viscoelásticas de las células de manera cualitativa y cuantitativa permiten una mejor comprensión de su biomecánica. Desde un punto de vista biomecánico, es esencial entender epiboly y no sólo demanda conocimiento de las medidas corticales de tensión y dinámica, que puede ser extraído por AFM; por lo tanto hay necesidad de información sobre las propiedades biofísicas del tejido. Para extraer esta información, se han desarrollado una variedad de técnicas de reología celular durante los años para caracterizar diversos tipos celulares bajo diferentes condiciones fisiológicas23. Incluyen AFM, MTC y pinzas ópticas (OT). Estos métodos, sin embargo, se ha demostrado insuficientes para análisis mesoscópica en la escala de embriones o de los órganos. Como alternativa, nos hemos adaptado con éxito seguimiento de nanopartículas microrheology6 para en vivo las medidas reológicas. Esta técnica analiza los desplazamientos browniano de las partículas individuales y deduce propiedades locales micromechanical.
Junto microrheology AFM y nanopartículas permiten la definición de cortical tensional dinámica y propiedades mecánicas internas de la yema durante epiboly. Esta información apoya plenamente un modelo en el que tensión anisotrópica se desarrolla como consecuencia de las diferencias en la respuesta de deformación de la Vet y la capa citoplasmática de yema de huevo (YCL) a la contracción isotrópica actomyosin de la corteza E YSL es esencial para el movimiento neto direccional del EVL y epiboly progresión1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí nos muestran que las propiedades del material y algunos parámetros biomecánicos de la célula de yema de huevo de pez cebra durante epiboly pueden ser fácilmente estimadas por AFM y nanopartículas de microrheology.
Mientras que AFM se ha empleado para recuperar características reológicas de las células y tejidos en condiciones fisiológicas4,5,25,28, aqu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Amayra Hernández-Vega y Philippe Alexandre Pouille por participar en la creación de la base de estos protocolos. También agradecemos a la plataforma de proyección de imagen Molecular IBMB-PCB, Xavier Esteban y los miembros del laboratorio de apoyo continuo. El programa de grupos consolidados de la Generalitat de Catalunya y DGI y becas Consolider del Ministerio de economía y competitividad de España OE y DN apoya esta labor.
Materials
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | – | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | – | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 |
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