Zebrafish भ्रूण जर्दी सेल में AFM और Microrheology
Summary
सामग्री गुण और vivo में तनावपूर्ण मापदंडों को मापने के लिए उपकरणों की कमी विकास के दौरान उनकी भूमिकाओं को मान्य रोकता है. हम परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) और nanoparticle-ट्रैकिंग epiboly के दौरान बरकरार zebrafish भ्रूण जर्दी सेल पर यांत्रिक सुविधाओं यों तो कार्यरत हैं । इन तरीकों विश्वसनीय और व्यापक रूप से घुसपैठ हस्तक्षेप से परहेज लागू कर रहे हैं ।
Abstract
Elucidating कारकों है कि प्रत्यक्ष ऊतकों को विकसित करने का spatio-लौकिक संगठन के विकास के अध्ययन में प्राथमिक प्रयोजनों में से एक है । विभिंन प्रस्ताव विभिंन विकासात्मक और morphogenetic प्रक्रियाओं में उनके spatiotemporal संगठन में कोशिकाओं और ऊतकों के यांत्रिक गुणों की समझ के लिए महत्वपूर्ण योगदान किया गया है का दावा है । हालांकि, vivo मेंसामग्री गुण और तनावपूर्ण मापदंडों को मापने के लिए विश्वसनीय और सुलभ उपकरणों की कमी के कारण, इन परिकल्पनाओं को मांय करना कठिन हो गया है । यहां हम वर्तमान परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) और कण epiboly के दौरान बरकरार zebrafish भ्रूण की जर्दी कोशिका के यांत्रिक गुणों को बढ़ाता है के उद्देश्य के साथ ट्रैकिंग काम करने के तरीके । Epiboly एक प्रारंभिक संरक्षण विकास प्रक्रिया है जिसका अध्ययन भ्रूण की पारदर्शिता के द्वारा सुविधा है । इन तरीकों को लागू करने के लिए सरल कर रहे हैं, विश्वसनीय, और व्यापक रूप से लागू करने के बाद से वे घुसपैठ हस्तक्षेप है कि ऊतक यांत्रिकी को प्रभावित कर सकता पर काबू पाने । एक सरल रणनीति नमूनों के बढ़ते, AFM रिकॉर्डिंग, और nanoparticle इंजेक्शन और ट्रैकिंग के लिए लागू किया गया था । यह दृष्टिकोण इन तरीकों को आसानी से अंय विकास के समय या जीवों के लिए अनुकूलनीय बनाता है ।
Introduction
भौतिक morphogenetic प्रक्रियाओं के यांत्रिक नियंत्रण अंतर्निहित सिद्धांतों मुख्यतः अपरिभाषित हैं । जबकि आणविक और सेलुलर स्तर पर यांत्रिक अध्ययन काफी गति से एकत्र कर रहे हैं, ऊतक/जीव स्तर पर यांत्रिक मापदंडों की खोज अपनी प्रारंभिक अवस्था में है । Hydrodynamic प्रतिगमन1 या वीडियो बल माइक्रोस्कोपी2 शोधकर्ताओं सक्रिय और निष्क्रिय बलों भेद करने के लिए अनुमति देते हैं, जबकि लेजर microsurgery3, या कम घुसपैठ परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) असंबद्ध कोशिकाओं के4 या vivo में 5 या nanoparticle microrheology6 एक ऊतक यांत्रिक गुणों और प्रतिक्रियाओं की प्रत्याशा अनुमति देते हैं ।
AFM एक जांच की सतह के साथ संपर्क पर ब्रैकट सुझावों के झुकाव से सतह किसी न किसी और अनुपालन को हल करने के उच्च परमाणु संकल्प के साथ एक तीन आयामी स्थलाकृतिक तकनीक है7। अलग AFM रोजगार के तरीके सतह संपत्तियों की जांच घर्षण, आसंजन बलों, और विविध सामग्रियों के viscoelastic गुणों को मापने सहित, विकसित किया गया है । हाल ही में, AFM जैविक नमूनों के यांत्रिक गुणों के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है । विशेष रूप से, AFM गैर-इनवेसिव एक माइक्रो टिप के साथ थरथरानवाला इंडेंट लागू करके एकल कोशिकाओं से जटिल कतरनी मापांक को दूर कर सकते हैं ज्ञात झुकने के एक ब्रैकट के लिए संलग्न लगातार8. यह हमें परिणामी बलों का अनुमान करने देता है । फिर भी, AFM अद्वितीय और विभिंन तरीकों से rheological डेटा और व्यक्तिगत कोशिकाओं (जैसे, Micropipette आकांक्षा9, चुंबकीय घुमा cytometry (MTC)10, या uniaxial तन्यता से यांत्रिक गुणों को निकालने की अनुमति नहीं है परीक्षण11) ।
फिर भी, जटिल morphogenetic प्रक्रियाओं के लिए इन उपंयास के तरीके के आवेदन सीधा नहीं है । मुख्य चुनौतियों का सामना करना पड़ा जब भ्रूण के ऊतकों के यांत्रिक गुणों का निर्धारण छोटे (µm मिमी), नरम (10 में2 -104 पीए रेंज) और विस्को-लोचदार (समय निर्भर घटना को जंम दे) सामग्री की प्रकृति12। इसलिए यह महत्वपूर्ण है के लिए यांत्रिक गुणों का निर्धारण (कठोरता, चिपचिपापन, आसंजन) भ्रूण और विकासशील जीवों के विशिष्ट मामले के लिए कार्यरत तरीकों को अनुकूलित । विकास का अध्ययन करने के लिए rheological दृष्टिकोण का विश्लेषण करते समय दो महत्वपूर्ण मुद्दों को ध्यान में रखा जाना चाहिए: घुसपैठी हस्तक्षेप से बचने के लिए और आसान पहुंच प्रदान करने के लिए । इस परिदृश्य में, micropipette आकांक्षा, MTC, और तन्यता परीक्षण प्रदर्श सीमाएं । पहले मामले में, उच्च विकृति है कि एक सेल पीड़ित अपने शारीरिक और यांत्रिक गुणों को बदल सकता है9। दूसरे मामले में, दृढ़ता से एक सब्सट्रेट करने के लिए प्रयोगात्मक ऊतक पालन करने के लिए सुनिश्चित करें कि तनाव ख़राब cytoskeleton स्थानीय रूप से भी ‘ कोशिकाओं सक्रियकरण राज्य पर प्रभाव लागू कर सकता है और, इसलिए, उनके यांत्रिक सुविधाओं में10 . पिछले, uniaxial तंयता दृष्टिकोण विकसित जीवों और पहुंच के11की ज्यामिति द्वारा सीमित हैं ।
AFM विकास प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए बेहतर अनुकूल लगता है क्योंकि यह किसी भी बोझिल नमूना तैयारी के बिना अपने प्राकृतिक वातावरण में सीधे जैविक नमूनों के अध्ययन की अनुमति देता है । इसके अलावा, भ्रूण के ऊतकों के पृथक्करण के रूप में आम तौर पर मुश्किल है, AFM जांच के कम आकार के मध्यम के प्रकार के चुनाव में कोई सीमा के साथ बहुमुखी प्रतिभा के एक उच्च डिग्री प्रदान करता है (या तो जलीय या गैर जलीय), नमूना तापमान, या रासायनिक नमूने की संरचना । AFM काफी बहुमुखी है करने के लिए लागू किया जा करने के लिए बड़े डोमेन और समय तराजू और विशिष्ट विकास चरणों या शारीरिक स्थितियों में ऊतकों की सामग्री गुण प्राप्त करने के लिए नियोजित किया गया है. पूरे देशी ऊतकों जैसे धमनियों13 या हड्डियों14 देखने के एक स्थलाकृतिक बिंदु से अध्ययन किया गया है और कुछ मामलों में, श्वेतपटल की तरह, यांत्रिक गुणों को भी प्राप्त किया गया है15. स्थलाकृति रहते भ्रूण में भी पता लगाया गया है के दृश्य की अनुमति, उदाहरण के लिए, सेल पुनर्व्यवस्था morphogenesis के दौरान Xenopus में16। पिछले, व्यापक नमूना तैयारी प्रोटोकॉल अलग विकासात्मक प्रक्रियाओं के दौरान यांत्रिक मापदंडों का निर्धारण करने के लिए विकसित किया गया है. Nanoindentation नक्शे लड़की भ्रूण पाचन तंत्र11के लिए देशी अनस्थिर ऊतक वर्गों पर उत्पंन किया गया है; चिपकने वाला और यांत्रिक गुण व्यक्तिगत बाह्यत्वक, त्वक, और अन्तः जनक gastrulating zebrafish भ्रूण4से पृथक कोशिकाओं के लिए प्राप्त; कठोरता epiblast और एवियन भ्रूण से explants पर आदिम लकीर के लिए प्रदर्शन किया माप17; और कठोरता ढाल का एक अलग पैटर्न सीधे Xenopus के भ्रूण मस्तिष्क में परिभाषित5।
भ्रूण के विकास की खोज के लिए AFM लागू करने के लिए एक महत्वपूर्ण गुणात्मक छलांग सरल सुलभ morphogenetic प्रक्रियाओं आ से आ सकता है । Zebrafish epiboly एक आवश्यक और संरक्षित घटना है, जिसमें विभिंन ऊतकों एक सीमित गोलाकार अंतरिक्ष में समंवय करने के लिए कुछ ही घंटों में blastoderm के विस्तार प्रत्यक्ष । zebrafish epiboly (गोलाकार चरण) की शुरुआत में, कोशिकाओं की एक सतही परत, ढंक परत (EVL), एक अर्द्ध बड़े पैमाने पर जर्दी syncytial कोशिका पर बैठे भ्रूण के पशु पोल पर केंद्रित blastomeres के गोलाकार टोपी शामिल हैं । Epiboly EVL के cortical वनस्पति वार्ड विस्तार, blastoderm की गहरी कोशिकाओं (dc), और जर्दी के आसपास syncytial जर्दी सेल (ई YSL) के बाहरी परत के होते हैं । Epiboly वनस्पति पोल18,19,20पर EVL और dc के बंद होने के साथ समाप्त होता है । कैसे और कहां बलों epiboly के दौरान उत्पंन कर रहे है और कैसे वे विश्व स्तर पर युग्मित है अभी तक1,21स्पष्ट नहीं है ।
यहाँ हम विस्तार में वर्णन कैसे vivo मेंzebrafish जर्दी सेल में epiboly प्रगति के दौरान निष्क्रिय यांत्रिक ऊतक संपत्तियों का अनुमान लगाने के लिए AFM लागू करने के लिए । ऐसा करने के लिए, हम जांच के रूप में AFM cantilevers से जुड़ी छोटी microspheres कार्यरत हैं । यह गैर वर्दी जर्दी सेल सतह के भीतर सटीक स्थानीय जानकारी की बहाली और तनाव ढाल और समय के साथ उनकी गतिशीलता का अध्ययन करने की अनुमति देता है । वैकल्पिक AFM दृष्टिकोण ऐसी कील cantilevers22का उपयोग करते हुए उन के रूप में, स्थानीय डेटा है कि पर्याप्त सटीक है रेंडर नहीं होगा । कील तकनीक, जो गोंद के लिए बहुत सावधान हेरफेर कौशल की आवश्यकता है एक कील ब्रैकट के अंत में नमूना आकार से बड़ा, भ्रूण की जांच के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है (~ 2-ब्रैकट की लंबाई से बड़ा गुना) यांत्रिकी ।
मॉडलिंग और गुणात्मक और मात्रात्मक तरीकों में कोशिकाओं के viscoelastic गुण निस्र्पक उनके यांत्रिक की एक बेहतर समझ के लिए अनुमति देता है । देखने के एक यांत्रिक बिंदु से, यह epiboly समझ आवश्यक है, और cortical तनाव माप और गतिशीलता है, जो AFM द्वारा निकाला जा सकता है पर न सिर्फ मांग ज्ञान; इस प्रकार वहाँ ऊतक के भौतिक गुणों के बारे में जानकारी के लिए की जरूरत है । इस जानकारी को निकालने के लिए, सेल rheology तकनीक की एक किस्म के वर्षों में विकसित किया गया है क्रम में विभिन्न शारीरिक शर्तों के तहत विभिन्न प्रकार के सेल को चिह्नित करने के लिए23. इनमें AFM, MTC और ऑप्टिकल चिमटी (ओटी) शामिल हैं । इन तरीकों, तथापि, भ्रूण या अंगों के पैमाने पर mesoscopic विश्लेषण के लिए अपर्याप्त साबित किया गया है । एक विकल्प के रूप में, हम सफलतापूर्वक nanoparticle ट्रैकिंग microrheology6 के लिए vivo rheological माप में अनुकूलित किया है । यह तकनीक व्यक्तिगत कणों के Brownian विस्थापनों का विश्लेषण करती है और स्थानीय micromechanical गुणों का अनुमान लगाती है.
एक साथ AFM और nanoparticle microrheology cortical तनावपूर्ण गतिशीलता और epiboly के दौरान जर्दी की आंतरिक यांत्रिक गुणों की परिभाषा की अनुमति देते हैं । यह जानकारी पूरी तरह से एक मॉडल है जिसमें अनिसोट्रोपिक तनाव EVL की विकृति प्रतिक्रिया में अंतर का एक परिणाम के रूप में विकसित करता है और जर्दी Cytoplasmic परत (YCL) ई के आइसोट्रोपिक actomyosin संकुचन YSL प्रांतस्था के लिए आवश्यक है समर्थन EVL और epiboly प्रगति के दिशात्मक नेट आंदोलन1.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम बताते है कि सामग्री गुण और epiboly के दौरान zebrafish की जर्दी कोशिका के कुछ यांत्रिक मापदंडों आसानी से AFM और नैनोकणों microrheology द्वारा अनुमान किया जा सकता है ।
जबकि AFM शारीरिक स्थितियों में कोशिकाओं ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अमायरा हर्नेनडेज़-वेगा और फिलिप-एलेक्जेंडर Pouille इन प्रोटोकॉल के लिए आधार स्थापित करने में भाग लेने के लिए धंयवाद । हम भी IBMB-पीसीबी, जेवियर Esteban और सतत समर्थन के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों से आणविक इमेजिंग मंच का शुक्र है । Generalitat de Catalunya और DGI और Competitivity अर्थव्यवस्था और स्पेन के EMB और डीएन के मंत्रालय से समेकन अनुदान के समेकित समूहों कार्यक्रम इस काम का समर्थन किया ।
Materials
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | – | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | – | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 |
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