Summary

DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל

Published: October 06, 2017
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר את האפיון של ה-DNA פולימראז סינתזה של דנ א שונה דרך התבוננות שינויים-סגול fluorescently שכותרתו הדנ א באמצעות אלקטרופורזה בג’ל ג’ל הדמיה. ג’לים אקרילאמיד משמשים עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של ההפרדה של חומצות גרעין קצר, אשר נודדים בקצב שונה בהתאם לגודל.

Abstract

עבור כל אנזים, שיטות חזקות, כמותיים נדרשים עבור אפיון של אנזימים הן מקומיים והן מהונדסים. עבור ה-DNA polymerases, לסינתזת DNA ניתן לאפיין באמצעות של במבחנה DNA סינתזה assay ואחריו לזיהוי בג’ל. המטרה של זה וזמינותו היא לכמת סינתזה של דנ א טבעי והן שהשתנו דנ א (M-DNA). גישות אלה שימושיים במיוחד ליישוב oligonucleotides עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד, המאפשרים תצפית של צעדים בודדים במהלך סינתזה oligonucleotide אנזימטיות. שיטות אלה הוחלו על ההערכה של מערך של ומאפייני הביוכימי biophysical כגון מדידת מצב יציב קצב קבועים של צעדים בודדים של סינתזת ה-DNA, שיעור שגיאה לסינתזת DNA, זיקה מחייבת את הדנ א. באמצעות שינוי רכיבים כולל, אך לא מוגבל, ששונה nucleoside triphosphates (NTP), מ- DNA ו/או מוטציה DNA polymerases, התועלת היחסית של המצע-DNA פולימראז זוגות ניתן להעריך בצורה יעילה. כאן, אנו מפרטים את הבדיקה עצמה, כולל השינויים חייבים להיעשות כדי להכיל את הדנ א תחל אנרגטיקה תיוג אסטרטגיות כגון-סגול fluorescently הנקרא DNA. בנוסף, שתוארו הצעדים הטכניים מכריע עבור ג’ל אקרילאמיד מוזג, פועל, אשר לעתים קרובות ניתן טכנית מאתגר.

Introduction

ה-DNA polymerases לבצע לסינתזת DNA מדויק ויעיל, חיוני לשמירה על תקינות הגנום. היכולת שהמנגנון מאות נוקלאוטידים בשנייה ובלי שגיאות גם עושה כלים חיוניים polymerases DNA ביולוגיה מולקולרית וביוטכנולוגיה. עם זאת, מאפיינים אלה גם להגביל את היישומים של סובסטרטים M-DNA; באופן כללי, polymerases DNA טבעי אינו יכול לסנתז סובסטרטים רבים מ- DNA ערך פוטנציאלי, ככל הנראה בשל כדי לחץ סלקטיבי גבוה נגד שימוש תקני מצעים ויוו. קבוצות רבות פיתחו גישות אבולוציה מכוונת ליצירת מוטציה polymerases DNA מסוגל M-DNA סינתזה1,2,3,4,5; מאמצים אלה הרחיבו את התועלת ביוטכנולוגי של ה-DNA-6,7,8.

כדי להעריך את היכולת של מוטציה polymerases DNA לסנתז M-DNA, אנחנו9,10, ועוד11,12,13 בדרך כלל להשתמש במבחנה מדידות של דנ א פעילות פולימראז, אשר מתוארים בכתב היד. בניסויים אלה, DNA polymerases הם incubated משותפת עם תוויות פריימר/תבנית דופלקס ותערובות טריפוספט nucleoside; המוצרים מוערכים על ידי אלקטרופורזה בג’ל. בהתאם ספציפי השאלה ניסיוני, מוטציה DNA polymerases, תחל ששונה, תבניות ששונו או ששונה nucleoside triphosphates יכול לשמש, הפעלת האבחון הביוכימי שיטתית של פעילות האנזים מוטציה.

מבחינה היסטורית, מבחני האלה צריכים לסמוך על 5′ רדיואקטיבי בתווית כדי לעקוב אחר לסינתזת DNA; בדרך כלל, היו בשימוש 32P ו- 33P; בדרך כלל, תיוג מושגת באמצעות T4 polynucleotide קינאז11. עם זאת, עקב סופיים שלמים עלות גבוהה יחסית רדיואקטיבי תוויות וסילוק בטוח שלהם, הקבוצה שלנו משתמש במקום זאת סינתטי 5′-סגול fluorophore הנקרא DNA. שימוש של imager ג’ל-סגול בעלות נמוכה יחסית, הבחנו דומה זיהוי גבולות. מחקרים קודמים באמצעות תוויות רדיואקטיבי (שלא פורסמו תוצאות). אנחנו בהצלחה שפירטתי בעבר תצפיות9, לא הבחנו הבדל כמותי גדול עם קצב בעבר נמדד קבועים (שלא פורסמו תוצאות).

כדי לנתח את הגודל של ה-DNA, וכך, היקף לסינתזת DNA, אנו מסתמכים על לזיהוי ג’ל אלקטרופורזה שיטות שפותחו במקור עבור רצף סנגר14 לפני כניסתו של נימי אלקטרופורזה15. המרחק של ההפרדה או ניידות יכול לשמש יחידת מידה משקל מולקולרי; פורמט גדול, ג’לים לזיהוי אנכי ניתן להשיג רזולוציה נוקלאוטיד יחיד, המאפשרים תצפית כמותית של ה-DNA oligonucleotides באורכים משתנים.

באופן קולקטיבי, הניסויים האלה הם שיטה חזקה אפיון פולימראז. לאור הזמן הרגיש של תגובות, הכנה וטיפול הכרחי להשגת תוצאות לשחזור. עוד יותר, ואילו הג’ל אקרילאמיד היא דרך יעילה מאוד למדוד לסינתזת DNA, כמו גם רבים אחרים DNA שינוי תגובות, עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד, זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית. פרוטוקול כאן בתקווה תאפשר למשתמשים לבצע ניסויים אלה תוך הימנעות הטעויות הנפוצות ביותר.

Protocol

1-פעילות Assay הערה: קיימים שני טיפוסי סוגים של מבחני זה פועלים בדרך כלל כדי לאפיין polymerases DNA בשיטות המתוארות כאן. הם נבדלים בין אם הם מאפיינים איכותית הכוללת סינתזה (הכולל שלבים רבים לסינתזת DNA) או אם הם באופן כמותי מתמקדים צעדים בודדים. אנו מתארים את הצעדים הדרושים עבור כל אחד מ?…

Representative Results

ניתוח מוצלח לזיהוי ג’ל של אפיון איכותי של פעילות הכוללת (המתוארת בסעיף 2.1, איור 1) ושל קינטיקה מצב יציב (המתואר בפתק המסקנה של סעיף 2.1, איור 2) מוצגים. ניתוח לא מוצלח לזיהוי ג’ל מוצג גם (איור 3). שי…

Discussion

. הנה, תארנו assay כדי לאפיין את הסינתזה בתיווך DNA פולימראז של M-DNA. באמצעות אינפרא אדום הקרוב תחל דנ א שכותרתו ולאחר שימוש בג’ל לזיהוי denaturing כדי לפתור oligonucleotides בגודל שונה, אפשר להשיג רזולוציה נוקלאוטיד יחיד ב- oligonucleotides, מאפשר מדידה מדויקת של סינתזה. גישות אלה ניתן למדוד גם את הפעילות הכוללת של ה?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי חברת מחקר לקידום מדעי (Cottrell המכללה מלומד פרס #22548) ועל ידי מנרב TriLink (ResearchReward גרנט #G139).

Materials

Tris HCl Promega H5123
Tris Base Promega H5131
MgCl2 Fisher Scientific BP214-500
Acetylated BSA Promega PR-R3961
KCl Sigma P4504
Dithiothreitol (i.e. DTT) Research Products International D11000
Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) Sigma 03690-100mL
Glycerol Sigma G5516
Formamide Acros AC42374-5000
Orange G Sigma Aldrich O3756
Bromophenol blue Fisher Scientific 50-701-6973
dNTPs Fisher Scientific FERR0191
M-dNTPs (riboNTPs) Fisher Scientific 45-001-341 (343, 345, 347)
M-dNTPs (all other modified NTPs) TriLink Biotechnologies assorted
primer 1 IDT DNA / TriLink Biotechnologies Custom Syntheses We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA
template 1 IDT DNA / TriLink Biotechnologies Custom Syntheses We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA
Acrylamide Research Products International A11405 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide
Tris/Borate/EDTA (TBE) solid Research Products International T22020
Urea ultrapure Research Products International U20200
Gel tape CBS Scientific GT-72-10
Large white spring clamp polypropylene CBS Scientific GPC-0001
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific BP179
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Fisher Scientific BP15020
0.75 mm spacers CBS Scientific SGS-20-0740A
33×42 Notched Glass Plate Set CBS Scientific SGP33-040A
Wedge plate separator CBS Scientific WPS-100
Comb for gel electrophoresis CBS Scientific SG33-0734
Gel electrophoresis rig CBS Scientific SG-400-33
ultrapure water we use a Milli-Q system from Millipore
DNA polymerases we prepare these in our laboratory using published protocols.

References

  1. Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
  2. Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
  3. Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
  4. Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
  5. Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2′-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
  6. Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2′-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
  7. Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
  8. Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2′-deoxy-2′-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
  9. Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2′-Modified Sugar Recognition. Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).
  10. Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
  11. Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
  12. Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).
  13. Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
  14. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  15. Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
  16. Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5′ to 3′ exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
  17. Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
  18. Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).
  19. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
  20. Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
  21. Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2′-5′ Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).

Play Video

Cite This Article
Lewis, E. L., Leconte, A. M. DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (128), e56228, doi:10.3791/56228 (2017).

View Video