Ensayo de actividad polimerasa de la DNA usando la DNA etiquetado fluorescente infrarroja visualizado por electroforesis en Gel de acrilamida
Summary
Este protocolo describe la caracterización de ADN polimerasa síntesis de ADN modificado a través de la observación de los cambios en el ADN fluorescente etiquetado infrarroja usando proyección de imagen de gel y electroforesis en gel. Geles de acrilamida se usan para obtener imágenes de alta resolución de la separación de los ácidos nucleicos cortos, que migran a distintas velocidades dependiendo del tamaño.
Abstract
Para cualquier enzima, robustos métodos cuantitativos son necesarios para la caracterización de las enzimas nativas y de ingeniería. Para polimerasas de la DNA, síntesis de ADN puede ser caracterizada mediante un en vitro síntesis análisis de ADN seguido de electroforesis en gel de poliacrilamida. El objetivo de este análisis es cuantificar la síntesis de ADN natural y DNA modificado (M-DNA). Estos enfoques son particularmente útiles para la resolución de oligonucleótidos con la resolución de un solo nucleótido, que permite la observación de pasos individuales durante la síntesis de oligonucleótidos enzimática. Estos métodos se han aplicado a la evaluación de una gran variedad de propiedades bioquímicas y biofísicas, como la medición de constantes de velocidad de estado estacionario de cada paso de la síntesis de ADN, la tasa de error de la síntesis de ADN y la afinidad de unión de ADN. Mediante el uso de modificado componentes incluyendo pero no limitado a, trifosfatos de nucleósidos modificados (NTP), M-ADN o mutantes polimerasas de la DNA, la utilidad relativa del sustrato-ADN polimerasa pares pueden evaluarse con eficacia. Detallamos aquí, el ensayo, incluyendo los cambios que deben realizarse para acomodar no tradicionales primer ADN etiquetado estrategias tales como la fluorescencia etiquetada ADN cerca de infrarrojo. Además, hemos detallado pasos técnicos cruciales para gel de acrilamida verter y correr, que puede a menudo ser un desafío técnico.
Introduction
Polimerasas de la DNA realizan precisa y eficiente la síntesis de ADN y son esenciales para mantener la integridad del genoma. La habilidad de sintetizar cientos de nucleótidos por segundo sin errores también hace herramientas esenciales de polimerasas de la DNA en biología molecular y biotecnología. Sin embargo, estas propiedades también limitan las aplicaciones de substratos DNA M; en términos generales, naturales polimerasas de la DNA no pueden sintetizar muchos sustratos potencialmente valiosos de M-DNA, probablemente debido a la alta presión selectiva contra la utilización de sustratos no estándar en vivo. Muchos grupos han desarrollado enfoques de evolución dirigida para generar mutantes polimerasas de la DNA capaces de M-DNA síntesis1a,2,3,4,5; estos esfuerzos han ampliado la utilidad biotecnológica de ADN6,7,8.
Para evaluar la capacidad del mutantes polimerasas de la DNA para sintetizar ADN M, tenemos9,10y otros11,12,13 suelen utilizar mediciones en vitro de ADN actividad de la polimerasa, que se describen en este manuscrito. En estos experimentos, polimerasas de la DNA son co incubados con una cartilla/plantilla etiqueta duplex y sustratos de trifosfato de nucleósido; los productos se evalúan por electroforesis en gel. Dependiendo de la pregunta experimental concreta, polimerasas de ADN mutantes, primers modificados, plantillas modificadas o los trifosfatos de nucleósidos modificados pueden utilizarse, permitiendo la evaluación bioquímica sistemática de la actividad de la enzima del mutante.
Históricamente, estos ensayos se han basado en una etiqueta radiactiva de 5′ a la síntesis de ADN; por lo general, se han utilizado 32P y 33P; por lo general, etiquetado se consigue utilizando T4 Polinucleótido quinasa11. Sin embargo, debido a la vida finita y relativamente alto costo de las etiquetas radiactivas y su disposición segura, nuestro grupo utiliza en cambio un fluoróforo de infrarrojo cercano de sintético 5′ etiquetado ADN. Utilizando a un toner de relativamente bajo costo de infrarrojo cercano de gel, hemos observado los límites de detección similares a estudios previos usando etiquetas radiactivas (resultados no publicados). Hemos reproducido con éxito más allá de observaciones9, y no hemos observado grandes diferencias cuantitativas con constantes de velocidad previamente medido (resultados no publicados).
Para analizar el tamaño del ADN y así, el grado de síntesis de ADN, contamos con métodos de electroforesis en gel de poliacrilamida desarrollados originalmente para secuenciación de Sanger14 antes de la llegada de electroforesis capilar15. La distancia de separación o de la movilidad puede ser utilizada como una medida del peso molecular; gran formato, geles verticales de poliacrilamida puede alcanzar la resolución de un solo nucleótido, que permite la observación cuantitativa de oligonucleótidos de ADN de diferentes longitudes.
Colectivamente, estos experimentos son un método robusto para la caracterización de la polimerasa. Debido al tiempo de naturaleza delicada de las reacciones, preparación y cuidado es necesario para lograr resultados reproducibles. Además, mientras que el gel de acrilamida es una forma altamente efectiva para medir la síntesis de ADN, así como numerosas otras DNA modificar reacciones, con la resolución de un solo nucleótido, puede ser un desafío técnico. Aquí el protocolo que permitirá a los usuarios para llevar a cabo estos experimentos evitando los errores más comunes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, hemos descrito un ensayo para caracterizar la síntesis mediada por la ADN polimerasa de la DNA de M. Utilizando cebadores de ADN etiquetados infrarrojo cercano, y usando electroforesis en gel de poliacrilamida de desnaturalización para resolver diverso tamaño de oligonucleótidos, podemos obtener la resolución de un solo nucleótido en oligonucleótidos, permitiendo una medición precisa de la síntesis. Estos enfoques se pueden utilizar para medir ya sea el conjunto de la actividad de la enzima (sección 2.1)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Corporación de investigación para el progreso científico (Cottrell Colegio académico Premio #22548) y biotecnologías TriLink (ResearchReward beca #G139).
Materials
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33×42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
References
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