Este artigo descreve um protocolo para a detecção de um ou mais plasma e/ou proteínas de membrana intracelular usando microscopia de super-resolução depleção do estado fundamental (GSD) em células de mamíferos. Aqui, vamos discutir os benefícios e as considerações do uso de tais abordagens para a visualização e a quantificação de proteínas celulares.
Avanços na fluorescente microscopia e biologia celular são intimamente correlacionados, com a maior capacidade de Visualizar eventos celulares, muitas vezes levando a saltos dramáticos na nossa compreensão de como as células função. O desenvolvimento e a disponibilidade de microscopia de super-resolução ampliou consideravelmente os limites de resolução óptica de ~ 250-20 nm. Os biólogos não estão mais limitados para descrever interações moleculares em termos de colocalization dentro de uma área de difração limitada, prefiro agora é possível visualizar as interações dinâmicas de moléculas individuais. Aqui, nós esboçamos um protocolo para a visualização e a quantificação de proteínas celulares por microscopia de depleção do estado fundamental para a imagem latente de celular fixo. Nós fornecemos exemplos de duas proteínas de membrana diferentes, um elemento de um membrana plasmática-localizada voltagem-dependente tipo L Ca2 + canal (CaV1.2), o retículo endoplasmático translocon e sec61β. Discutidos são os parâmetros específicos do microscópio, métodos de fixação, foto-interruptor formulação da reserva e armadilhas e desafios de processamento de imagem.
Reações de sinalização celulares traduzem mudando ambientes internos e externos para iniciar uma resposta celular. Eles regulam todos os aspectos da fisiologia humana, servindo como base para o hormônio e liberação de neurotransmissores, o batimento cardíaco, visão, fertilização e função cognitiva. Interrupção destas cascatas de sinalização pode ter consequências graves na forma das condições fisiopatológicas, incluindo a doença de Alzheimer, Parkinson e câncer. Durante décadas, biológicos e médicos investigadores usaram com sucesso proteínas fluorescentes, sondas e biosensores juntamente com microscopia de fluorescência, como as principais ferramentas para compreender a organização espacial e temporal precisa desses celulares sinais.
Os pontos fortes de técnicas ópticas como epifluorescência, confocal, ou microscopia de fluorescência (TIRF) de reflexão interna total são sua sensibilidade, velocidade e compatibilidade com imagens de células vivas, enquanto a principal limitação é a sua resolução de difração limitada, estruturas de significado ou complexos de proteínas menores que 200-250 nm não podem ser resolvidos. Com o desenvolvimento teórico e prático de super-resolução determinístico (estruturado, por exemplo, emissão estimulada depleção microscopia (STED1), microscopia de iluminação (SIM2) ou estocástica Super-resolução (por exemplo, , fotoativados localização microscopia (PALM3), ou estado fundamental depleção (GSD4,5)), resolução axial e lateral em microscopia de fluorescência foi estendida para além da barreira de difração, a ordem de dezenas de nanômetros. Assim, os investigadores agora têm a capacidade incomparável de Visualizar e compreender como a organização e dinâmica da proteína se traduz em função ao nível molecular perto.
Microscopia de depleção estado fundamental individual molécula de retorno (GSDIM), ou simplesmente GSD como é conhecido, contorna o limite de difração, reduzindo o número de simultaneamente emitindo fluorophores4,5. Luz de laser de alta energia é usada para excitar a amostra com rótulo fluoróforo, bombardeando elétrons com fótons e aumentando a probabilidade de eles passam por um ‘spin-flip’ e insira o triplet ou ‘escuro ‘ estado do estado excitado4. Isso efetivamente esgota o estado da terra, daí o nome ‘terrestres depleção do estado’. No estado triplete, fluorophores não emitem fótons e a amostra aparece mais não ofuscante. No entanto, estes fluorophores estocàstica retornar para o estado do solo e pode passar por vários fótons emitindo as transições de estado excitado-terra antes de retornar ao estado tripleto. Com menos fluorophores emitindo em um determinado momento, rajadas de fótons emitidos a partir fluorophores individuais tornam-se espacial e temporalmente distintas das vizinhas fluorophores. A explosão de fótons pode ser cabido com uma função gaussiana, o centroide calculado que corresponde à posição do fluoróforo com uma precisão de localização que é dependente da abertura numérica (NA) da lente, o comprimento de onda da luz usada para excitação e crucialmente, o número de fótons emitidos por fluoróforo. Uma limitação do GSD é que, uma vez que apenas um subconjunto de fluorophores ativamente emite a qualquer momento, milhares de imagens devem ser recolhidas ao longo de vários minutos para construir um mapa de localização completa. O tempo de aquisição tempo combinado com a exigência de laser de alta potência, significa que a GSD é mais adequado para fixo ao invés de amostras vivas.
Neste artigo, descreve a preparação de amostras fixas para imagem de microscopia de super-resolução de membrana e o retículo endoplasmático (ER)-proteínas residentes (para uma lista de reagentes ver a Tabela de materiaise consumíveis necessários). Exemplos de como este protocolo pode ser facilmente adaptado para quantificar o tamanho e o grau de agrupamento do tipo L voltagem Ca2 + canais (Cav1.2) no sarcolema dos miócitos, ou usado para visualizar a distribuição celular de emergência, são demonstradas. Compreender a distribuição e a organização desses componentes celulares é criticamente importante na compreensão da iniciação, tradução e, finalmente, a função de muitos Ca2 +-dependentes cascatas de sinalização. Por exemplo, canais de Cav1.2 são fundamentalmente importantes para a excitação-contração, acoplamento, enquanto mediada Ca2 + lançamento da emergência é talvez a mais ubíqua cascata de sinalização em células de mamíferos.
A recente explosão de tecnologias que permitem a geração de imagens para além do limite de difração ofereceram novas janelas para as complexidades da pilha mamífera sinalização no espaço e no tempo. Essas tecnologias incluem tempestade, STED, PALM, GSD, SIM e suas variantes (por exemplo, dSTORM, FPALM). A engenhosidade dos cientistas por trás destas técnicas permitiu-nos contornar as limitações impostas pelas leis da física que regem a difração de luz. Apesar desta grande realização, cada uma …
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por uma concessão da AHA a R.E.D (15SDG25560035). Autores gostaria de reconhecer o Dr. Fernando Santana para uso do microscópio Leica SR GSD 3D e Dr. Johannes Hell para gentilmente fornecendo o anticorpo FP1.
KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
#1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
10X PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1X with de-ionized water |
Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
ImageJ | |||
Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |