Super resolutie beeldvorming van de uitputting van de grondtoestand in zoogdiercellen
Summary
Dit artikel schetst een protocol voor de detectie van een of meer plasma en/of intracellulaire membraaneiwitten grondtoestand uitputting (GSD) Super resolutie microscopie met zoogdiercellen. Hier bespreken we de voordelen en de overwegingen van het gebruik van dergelijke benaderingen voor de visualisatie en de kwantificering van cellulaire eiwitten.
Abstract
Voorschotten in fluorescent microscopie en celbiologie zijn nauw gecorreleerd, met de verbeterde mogelijkheid om te visualiseren van cellulaire gebeurtenissen die vaak leiden tot dramatische sprongen in ons begrip van hoe cellen functie. De ontwikkeling en beschikbaarheid van super resolutie microscopie is aanzienlijk uitgebreid de grenzen van de optische resolutie van ~ 250-20 nm. Biologen zijn niet langer beperkt tot het beschrijven van de moleculaire interacties in termen van colocalization binnen een gebied van diffractie beperkt, eerder het is nu mogelijk om te visualiseren de dynamische interacties van afzonderlijke moleculen. Hier duidelijk naar voren komt een protocol voor de visualisatie en de kwantificering van cellulaire eiwitten door uitputting van de grondtoestand microscopie voor beeldvorming van de vaste cel. We bieden voorbeelden uit twee verschillende membraaneiwitten, een element van het endoplasmatisch reticulum-translocon, sec61β, en een plasmamembraan-gelokaliseerde spanning-gated L-type Ca2 + kanaal (CaV1.2). Besproken zijn de specifieke Microscoop parameters, fixatie methoden, foto-switching buffer formulering, valkuilen en uitdagingen van de beeldverwerking.
Introduction
Cellulaire signalering reacties vertalen veranderende interne en externe omgeving om te beginnen een cellulaire respons. Ze regelen alle aspecten van de menselijke fysiologie, de Stichting hormoon en neurotransmitter release, hartslag, visie, bevruchting, en cognitieve functie bijeenkomen. Verstoring van deze signalering cascades kan ernstige gevolgen in de vorm van pathofysiologische omstandigheden waaronder kanker, Parkinson en de ziekte van Alzheimer hebben. Voor decennia, heb biologische en medische onderzoekers met succes gebruikt fluorescente proteïnen, sondes en biosensoren fluorescentie microscopie gekoppeld als de belangrijkste instrumenten om te begrijpen van de precieze ruimtelijke en temporele organisatie van deze mobiele signalen.
De troeven van optische technieken zoals epifluorescence, confocal, of totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie zijn hun gevoeligheid, snelheid en compatibiliteit met levende cel imaging, terwijl de grote beperking is hun diffractie-beperkte resolutie, zin structuren of eiwitcomplexen kleiner dan 200-250 nm kunnen niet worden opgelost. Met de ontwikkeling van het theoretische en praktische van deterministische super resolutie (bijvoorbeeldgestimuleerde emissie uitputting microscopie (STED1), gestructureerd verlichting microscopie (SIM2) of stochastische super resolutie (bv , photoactivated lokalisatie microscopie (PALM3) of grondtoestand uitputting (GSD4,,5)), laterale en axiale resolutie fluorescentie microscopie is uitgebreid buiten de diffractie barrière, aan de orde van tientallen nanometer. Onderzoekers hebben dus nu de ongeëvenaarde mogelijkheid te visualiseren en te begrijpen hoe de dynamiek van de eiwitten en organisatie vertaalt naar functie op in de buurt van-moleculair niveau.
Grondtoestand uitputting microscopie gevolgd door individuele molecuul terugkeer (GSDIM), of gewoon GSD omzeilt genoemd, u de limiet van diffractie door het verminderen van het aantal gelijktijdig uitstoten fluorophores4,5. Hoge-energie laserlicht wordt gebruikt voor het prikkelen van het monster fluorophore-geëtiketteerd, bombarderen van elektronen met fotonen en het vergroten van de kans dat zij zal ondergaan een ‘spin-flip’ en voer de triplet of ‘donker-state’ van de geëxciteerde toestand4. Dit effectief de grondtoestand uitput, vandaar de naam ‘de grond staat uitputting”. In de triplet, fluorophores doen niet het uitstoten van fotonen en het monster verschijnt dimmer. Echter deze fluorophores stochastically terug naar de grondtoestand en verschillende foton uitstoten opgewonden-grond staat overgangen voordat hij terugkeerde naar de triplet staat kunt doorlopen. Met minder fluorophores uitstoten te allen tijde, uitgezonden foton uitbarstingen van individuele fluorophores ruimtelijk en stoffelijk losstaat van het naburige fluorophores geworden. De uitbarsting van fotonen worden past met een Gauss functie, de berekende centroid die correspondeert met de positie van de fluorophore met een nauwkeurigheid van lokalisatie die afhankelijk is van de numerieke diafragma (NA) van de lens, de golflengte van het licht gebruikt voor excitatie en cruciaal, het aantal fotonen uitgezonden per fluorophore. Een beperking van de GSD is dat, aangezien slechts een subset van fluorophores actief op elk gewenst moment stoot, duizenden beelden gedurende enkele minuten op te bouwen een volledige lokalisatie-kaart moeten worden verzameld. De lange acquisitietijd in combinatie met de hoge laser machtsvereiste, betekent dat de GSD is beter geschikt voor vaste in plaats van live monsters.
Dit artikel beschrijft de voorbereiding van vaste monsters voor super-resolutie microscopie beeldvorming van membraan en endoplasmatisch reticulum (ER)-resident eiwitten (voor een lijst van de nodig materialen en reagentia Zie de Tabel van de materialen). Voorbeelden van hoe dit protocol kan gemakkelijk aangepast om te kwantificeren van de grootte en de mate van clustering van L-type spanning-gated Ca2 + kanalen (Cav1.2) in het sarcolemma van cardiale myocytes of gebruikt voor het visualiseren van de cellulaire verdeling van de ER, worden aangetoond. Inzicht in de distributie en de organisatie van deze cellulaire componenten is uitermate belangrijk bij het begrijpen van de inleiding, vertaling, en uiteindelijk de functie van vele Ca2 +-afhankelijke signalering cascades. Bijvoorbeeld, zijn Cav1.2 kanalen fundamenteel belang voor de excitatie-contractie koppeling, terwijl receptor-gemedieerde Ca2 + vrijlating uit de ER misschien wel de meest alomtegenwoordige signalering cascade in zoogdiercellen is.
Protocol
Representative Results
Discussion
De recente explosie van technologieën waarmee imaging voorbij de diffractie-limiet hebben aangeboden nieuwe Vensters in de complexiteit van zoogdieren cel signalering in ruimte en tijd. Deze technologieën omvatten STORM, STED, PALM, GSD, SIM en hun varianten (b.v., dSTORM, FPALM). De vindingrijkheid van de wetenschappers achter deze technieken hebben ons tot het omzeilen van de beperkingen die worden opgelegd door de wetten van de fysica bestuur de diffractie van licht. Ondanks deze enorme prestatie, elk van d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een subsidie van de AHA R.E.D. (15SDG25560035). Auteurs wil erkennen Dr Fernando Santana voor gebruik van zijn Leica SR GSD 3D Microscoop, en Dr. Johannes Hell voorziet vriendelijk het FP1 antilichaam.
Materials
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10X PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1X with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit. JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
- Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. Phys Rev Lett. 98 (21), 218103 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302 (2011).
- Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging. FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).
- Dempsey, G. T., et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes. J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
- Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
- Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies. Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).
- Dixon, R. E., et al. Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels. Elife. 4, (2015).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy. Sci Rep. 5, 14072 (2015).
