In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, für die Erkennung von in Vivo Antigen-spezifische Tötung einer Ziel-Zelle in einem Mausmodell ermöglichen.
Abstract
Aktuelle Methoden zur antigenspezifischen Tötung sind beschränkt auf in-vitro- Verwendung oder bei Infektionskrankheiten Modelle verwendet. Allerdings gibt es kein Protokoll speziell antigenspezifischen töten ohne eine Infektion zu messen. Dieses Protokoll dient und beschreibt Methoden, um diese Einschränkungen zu überwinden, indem es ermöglicht für den Nachweis von Antigen-spezifische Tötung von einer Zielzelle durch CD8+ T-Zellen in Vivo. Dies geschieht durch eine Impfung-Modell mit einem traditionellen CFSE–markierten Ziel töten Assay zusammenführen. Diese Kombination erlaubt es den Forscher, die Antigen-spezifische CTL Potenzial zu bewerten, direkt und schnell, da der Test nicht Tumorwachstum oder Infektion abhängig ist. Darüber hinaus das Auslesen basiert auf Durchflusszytometrie und so die meisten Forscher leicht zugänglich sein sollten. Die große Einschränkung der Studie ist die Zeitachse in Vivo identifizieren, die die Hypothese getestet werden. Variationen in Antigen Stärke und Mutationen in T-Zellen, die im Differenzial Zytolyse-Funktion ergeben müssen sorgfältig geprüft werden, um den optimalen Zeitpunkt für die Zellernte und Bewertung zu bestimmen. Die entsprechende Konzentration des Peptids für die Impfung wurde optimiert für hgp10025-33 und OVA257-264, aber weitere Validierung für andere Peptide, die möglicherweise besser geeignet, eine gegebene Studie benötigt werden würde. Insgesamt dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Funktion in Vivo zu töten und kann an jedem bestimmten Antigen angepasst werden.
Introduction
Mehrere Protokolle gibt es zur Beurteilung der Zytolyse (CTL) Potenzials eine CD8+ oder CD4+ T-Zellen. Diese Einschätzung kann ohne weiteres in Vitro unter kontrollierten Bedingungen1,2,3erfolgen. Darüber hinaus haben Infektionskrankheit Modelle, wie z. B. LCM, CTL-Funktion durch den Einsatz von differentiell CFSE-(5-(and 6)-Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester) mit der Bezeichnung Zielzellen klassisch geprüft wo die CFSE-Hallo-markierte Zellen sind gepulst mit einem Peptid und CFSE-lo-ungepulsten beschrifteten Ziel Zellen sind links. Die Zellen sind dann im Verhältnis 1:1 gespritzt und bewertet für den Verlust von den CFSE-Hallo-gepulste Ziele von Flow Cytometry4beschriftet. Impfstoff und Ablehnung Modelle haben auch ähnliche Strategien zur Beurteilung der in Vivo zu töten, indem beide CD8 verwendet+ und CD4-Zellen sowie NK Zellen5,6+ T. Dies ist ein leistungsfähiges Assay, sondern erfordert die Verwendung von Infektionserregern, die das Immunsystem vor der Ziel-Injektion prime.
Dieses Protokoll auf der anderen Seite erfordert keine vorherige Infektion des Wirtes und nutzt stattdessen eine Impfstrategie um das Immunsystem vor der Ziel-Injektion prime. Diese Impfung ist eine wasserbasierte Formulierung der Peptid-Impfstoff, der Bereitstellung von einer immunstimulierenden cocktail namens Covax7, bestehend aus einem Toll-Like Rezeptor 7 (TLR7) erfordert bestehend Agonist (Imiquimod-Creme), eine agonistische Anti-CD40 Antikörper und Interleukin-2 (IL-2) führt zu synergistische Kombination von immunstimulierenden Agenten für die Erhebung von Peptid-spezifische Grundierung und robuste Immunantwort. Als solches bietet dieser Assay eine schnellere Auslesen der CTL-Funktion, da der Impfstoff nur drei Tage vor der Injektion von den Zielzellen zusammen mit den Zellen zur Beurteilung der Funktion verwaltet wird. Darüber hinaus ist die Covax Grundierung stark genug, dass die Tötung Kapazität des grundiert antigenspezifischen T-Zellen zwischen 4 und 24 h nach der Injektion gesehen werden kann.
Die größte Beschränkung dieses Protokolls ist die Zeitachse in Vivo für den Nachweis von Ziel Tötung identifizieren, die angebracht ist, das Antigen und die Hypothese getestet. Sorgfältige Bewertung durchgeführt werden muss, als Variationen in Antigen Stärke sowie genetische Veränderungen in T-Zellen getestet Differenzial CTL-Funktion führen, die eine Erkennung von unterschiedlichem Timing Ziel töten erfordern würde. Darüber hinaus zwar die entsprechende Konzentration des Peptids für Impfung für menschlichen Melanom Antigen Glycopeptide 100 (hgp10025-33) optimiert wurde und Ovalbumin257-264 (OVA257-264)8,9 , Verwendung eines anderen Antigen-Modells, die möglicherweise besser geeignet, eine gegebene Studie würde weitere Validierung erfordern. Optimierung der IL-2 Dosis Konzentration und Dosis Frequenz möglicherweise aufgrund erwarteten Unterschiede in einem Ziel-Antigene Kapazität, CTL-Effektor-Funktion in Kombination mit der Covax als Adjuvans zu stimulieren muss das gewünschte Ziel zu erreichen. Insgesamt ist dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Funktion in Vivo zu töten und kann an jedem bestimmten Antigen angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während dieses Protokolls sehr einfach ist, gibt es ein paar wichtige Schritte, die sorgfältig durchgeführt werden müssen. Die Covax Grundierung nach Injektion von antigenspezifischen T-Zellen getestet ist notwendig, um jegliches Töten der gepulsten Ziele zu sehen. Es ist zwar möglich, dass die wässrige Covax Impfung eine akute entzündliche Erkrankung, für die chronischen entzündlichen Phase schafft kann anstelle der kurzlebigen wasserbasierte Formulierung mit einem langsam-Antigen Version Öl basierenden Ansat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird unterstützt von der NIH Forschung (A1R03AI120027 (RN) und 1R21AI20012 (RN)), institutionelle Research Grant (RN), Start-up zu gewähren (RN) und MD Anderson CIC Samen zu gewähren (RN).
Materials
| 6- to 12-week old female C57BL/6 mice | Charles River | 027 | C57 Black 6 mice |
| OT-1 6-12-week old female mice | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025–33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257–264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod cream 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| CD40-specific mAb | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 protein | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Recombinant human IL-2 protein |
| 70% isopropyl alcohol Prep | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | fetal bovine serum |
| RBC lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | red blood cell lysis buffer |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillin/streptomycin |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1.5 mL MCT graduated natural | Fisher | 05-408-129 | microcentrifuge tube |
| 70% ethanol | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 |
References
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